Química amputação e regeneração da faringe nos Turbellaria mediterranea Schmidtea
Summary
A Turbellaria mediterranea Schmidtea é um excelente modelo para o estudo de células-tronco e regeneração de tecidos. Esta publicação descreve um método para remover seletivamente um órgão, a faringe, expondo os animais para a química de azida sódica. Este protocolo também descreve métodos para monitorar a regeneração da faringe.
Abstract
Boca é platelmintos que são extremamente eficientes em regeneração. Eles devem esta capacidade a um grande número de células-tronco que podem responder rapidamente a qualquer tipo de lesão. Modelos de lesões comuns nestes animais remover grandes quantidades de tecido, que danifica a vários órgãos. Para superar este dano de tecido largo, descrevemos aqui um método para remover seletivamente um único órgão, a faringe, na Turbellaria Schmidtea mediterranea. Conseguimos isso por animais de imersão em uma solução contendo o citocromo oxidase inibidor de azida sódica. Breve exposição a azida de sódio provoca extrusão da faringe do animal, que chamamos de “amputação química.” Amputação química remove a faringe inteira e gera uma pequena ferida onde a faringe anexa para o intestino. Após enxaguar extensa, todos os animais amputados regeneram uma faringe totalmente funcional em cerca de uma semana. Células-tronco no resto do corpo conduzir a regeneração da faringe nova. Aqui, nós fornecemos um detalhado protocolo para amputação de química e descrever métodos histológicos e comportamentais para avaliar o sucesso amputação e regeneração.
Introduction
Regeneração é um fenômeno que ocorre em todo o reino animal, com capacidades regenerativas de regeneração de corpo inteiro em certos invertebrados para habilidades mais restritas em vertebrados1. Substituição de tecidos funcionais é um processo complexo e muitas vezes implica a restauração simultânea de vários tipos de células. Por exemplo regenerar o membro salamandra, osteoblastos, condrócitos, neurônios, músculos e células epiteliais precisa ser substituído2. Estes tipos de células recém-gerado também precisam ser organizado corretamente, para facilitar a nova função de membro. Compreensão destes processos complexos requer técnicas que se concentram na regeneração de tipos específicos de células e a sua integração em órgãos.
Uma das estratégias empregadas para simplificar o estudo das respostas regenerativas é a ablação alvo de certos tipos de célula ou maiores coleções de tecidos. Por exemplo, no zebrafish, expressão de nitroreductase em tipos específicos de células leva à sua destruição após a aplicação de metronidazol3,4. Em larvas de Drosophila , expressar genes pro-apoptotic sob promotores tecido-específica pode seletivamente ablate regiões específicas do disco imaginária5,6. Ambas estas estratégias causam dano rápido mas controlado e têm sido usadas para dissecar os mecanismos moleculares e celulares responsáveis pela regeneração.
Este manuscrito, descrevemos um método para ablate seletivamente um órgão inteiro chamado faringe na Turbellaria Schmidtea mediterranea. Boca é um modelo clássico de regeneração, conhecido por sua capacidade regenerativa prolífica, onde fragmentos mesmo minutos podem regenerar toda animais 7,8. Eles têm uma população grande e heterogênea de células-tronco que consiste de células pluripotentes e restrita a linhagem progenitores9,10,11. Estas células proliferam e se diferenciam para substituir todos os tecidos desaparecidos, incluindo a faringe, sistemas nervosos, digestivos e excretoras e músculo e células epiteliais9,10,12. Enquanto nós sabemos que essas células-tronco iniciar a regeneração, podemos não compreender plenamente os mecanismos moleculares que conduzi-los para substituir todos esses diferentes tipos de células. Definidos métodos ferindo que eliciam respostas precisas células-tronco podem ajudar a delinear este complexo processo.
A faringe é um tubo cilíndrico, grande necessário para a alimentação e contém neurônios, músculos, células epiteliais e secretora13,29. Normalmente escondidos em uma bolsa no lado ventral do animal, que se estende através do único corpo do animal, abrindo em cima sentindo a presença de alimentos. Para seletivamente amputar a faringe, nós mergulhe a boca em uma químico chamado azida sódica, uma anestesia comumente usada em c. elegans14,15,16. Seu uso na boca foi primeiramente relatado por Adler et al., em 2014,12. Em poucos minutos de exposição a azida de sódio, boca extrude seus pharynges, e com agitação suave, faringe desconecta-se do animal. Nos referimos a esta perda completa e seletiva da faringe como “química amputação”. Uma semana após a amputação, uma faringe totalmente funcional é restaurado12. Porque a faringe é necessária para a alimentação, regeneração funcional pode ser medida pelo monitoramento do comportamento alimentar. Abaixo, descrevemos o protocolo para amputação de química e para avaliar a regeneração da faringe e restauração do comportamento alimentar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método da ablação seletiva da faringe usando a azida de sódio. Outros estudos de ablação alvejado na boca têm usado modificada cirurgia para remover fotorreceptores21 ou tratamento farmacológico para ablação de neurônios dopaminérgicos22. Uma vantagem significativa de amputação química sobre os métodos existentes é que não requer cirurgia. A estrutura rígida da faringe em comparação com o resto do corpo Turbellaria facilita a …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gostaríamos de agradecer a Alejandro Sánchez Alvarado, que apoiaram a otimização inicial e desenvolvimento desta técnica. Trabalho no laboratório de Carolyn Adler é suportado por fundos de start-up da Universidade de Cornell.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
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