Kimyasal amputasyon ve yeniden oluşturulmasını Planarian Schmidtea mediterranea yutak
Summary
Planarian Schmidtea mediterranea kök hücre ve doku rejenerasyonu çalışmak için mükemmel bir modeldir. Bu yayın seçerek bir organ, yutak, kimyasal sodyum azid hayvanlara açarak kaldırın yöntemi açıklanır. Bu iletişim kuralı Ayrıca yutak rejenerasyon izlemek için yöntem açıklar.
Abstract
Planarians yeniden oluşturma işlemi son derece verimli solucanlar vardır. Bu yeteneği hızla herhangi bir yaralanma türüne yanıt verebilir kök hücreler çok sayıda borçlular. Bu hayvanların ortak yaralanma modellerinde birden çok organları zarar doku büyük miktarda kaldırın. Bu geniş doku hasarı üstesinden gelmek için burada seçerek tek bir organ, yutak, planarian Schmidtea mediterraneakaldırmak için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu sitokrom oksidaz inhibitörü sodyum azid içeren bir çözümde iliklerine hayvanlar tarafından elde etmek. Sodyum azid kısa maruz kalma “kimyasal amputasyon.” dediğimiz hayvan yutak ekstrüzyon neden olur Kimyasal amputasyon tüm yutak kaldırır ve nerede yutak bağırsak için verdiği küçük bir yara oluşturur. Geniş durulama sonra tüm uzvunu hayvanların yaklaşık bir hafta içinde tamamen işlevsel bir yutak yeniden. Vücudun geri kalanıyla kök hücre yenilenme yeni yutak sürücü. Burada, bir ayrıntılı sağlamak protokol için kimyasal amputasyon ve başarılı amputasyon ve rejenerasyon değerlendirmek için histolojik ve davranış yöntemleri açıklanmaktadır.
Introduction
Rejenerasyon hayvanlar alemi tam vücut yenilenme içinde bazı omurgasızlar omurgalıların1daha sınırlı yetenekleri için arasında değişen rejeneratif kapasiteleri ile ortaya çıkan bir olgudur. Yedek fonksiyonel dokuların karmaşık bir süreçtir ve genellikle birden çok hücre tiplerinin eşzamanlı restorasyon üzerine kuruludur. Örneğin, semender uzuv, dokusunu, kondrosit, nöronlar, kas ve epitel hücreleri gerek yeniden oluşturmak için2yerini aldı. Bu yeni oluşturulan hücre tipleri de düzgün yeni bacak işlevini kolaylaştırmak için organize olmak gerekir. Bu karmaşık süreçleri anlamak belirli hücre tipleri ve organları kendi entegrasyon rejenerasyon odaklanmak teknikler gerektirir.
Rejeneratif yanıt-e doğru çalışma kolaylaştırmak için istihdam stratejileri ya belirli hücre tiplerinin hedeflenen ablasyon veya dokuların daha büyük Koleksiyonlar biridir. Örneğin, Zebra balığı, Metronidazol3,4uygulamadan sonra imha edilmesini ifade belirli hücre tipleri içinde nitroreductase yol açar. Drosophila larva pro-apoptotik genler doku özel Organizatör altında ifade seçerek özel bölgeler Imaginal disk5,6ablate. Bu stratejileri her ikisi de hızlı ama kontrollü zarar ve moleküler ve hücresel yenilenme için sorumlu mekanizmaları incelemek için kullanılır.
Bu makale, seçmeli olarak tüm organ yutak planarian Schmidtea mediterraneaadlı ablate için bir yöntemi açıklanmaktadır. Planarians nerede bile dakika parçaları bütün hayvanlar 7,8regrow rejenerasyon, üretken rejeneratif yeteneklerini bilinen klasik bir model vardır. Kök hücreler pluripotent hücreler ve soy tarafından kısıtlanmış ataları9,10,11oluşan büyük, türdeş olmayan nüfusu var. Bu hücreler çoğalırlar ve yutak, gergin, sindirim ve boşaltım sistemleri ve kas ve epitel hücreleri9,10,12de dahil olmak üzere tüm eksik dokular yerine ayırt etmek. Bu kök hücre yenilenme başlatmak biliyoruz iken, biz tam olarak onları tüm bu farklı hücre türleri yerine götürmek moleküler mekanizmaları kavramak değil. Kesin kök hücre yanıt-e doğru çıkarmak tanımlanan yaralama yöntemleri bu karmaşık süreci belirginleştiren yardımcı olabilir.
Yutak beslenmesi için gerekli bir büyük, silindirik tüp ve nöronlar, kas, epitelyal ve salgı hücreleri13,29içerir. Normalde hayvan ventral tarafta bir kese içinde gizli, hayvanın tek vücut yiyecek varlığı algılama üzerine açılış ile uzanır. Seçmeli olarak yutak kesmek için bir kimyasal denilen sodyum azid, yaygın olarak kullanılan bir anestezi C. elegans14,15,16planarians emmek. Planarians kullanımı ilk Adler ve arktarafından bildirildi., 201412. Sodyum azid maruz dakikada planarians onların pharynges bükün ve nazik ajitasyon ile yutak hayvandan ayırır. Biz bu yutak tam ve seçici kaybına yol “kimyasal amputasyon” bakın. Bir hafta sonra amputasyon, tamamen işlevsel bir yutak geri yüklenen12olur. Yutak beslenmesi için gerekli olduğundan, fonksiyonel rejenerasyon beslenme davranışı izleyerek ölçülebilir. Aşağıda, protokolü için kimyasal amputasyon ve yutak yenileme ve restorasyon davranış beslenme değerlendirmek açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu iletişim kuralı sodyum azid kullanarak yutak seçici ablasyon yöntemi açıklar. Planarians diğer hedeflenen ablasyon çalışmaları değiştirilmiş ameliyat photoreceptors21 veya farmakolojik tedavi dopaminerjik nöron22ablate kaldırmak için kullandık. Bir önemli mevcut yöntemler üzerinde kimyasal amputasyon cerrahisi gerektirmez avantajdır. Planarian vücut diğerleri ile karşılaştırıldığında farklıdır yutak katı yapısını çok daha yumuşak g…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Alejandro Sánchez Alvarado, ilk iyileştirme ve geliştirme bu tekniğin desteklenen teşekkür etmek istiyorum. Carolyn Adler’in laboratuvar çalışmalarında Cornell Üniversitesi başlangıç fonlar tarafından desteklenir.
Materials
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Fisher Chemical | C79-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Sulfate Anhydrous (MgSO4) | Fisher Chemical | M65-3 | Montjuïc salt solution |
| Magnesium Chloride Hexahydrate (MgCl2) | Acros/VWR | 41341-5000 | Montjuïc salt solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Acros Organics/VWR | 196770010 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Acros Organics/VWR | 207790050 | Montjuïc salt solution |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Acros Organics/VWR | 123360010 | Montjuïc salt solution |
| Nalgene autoclavable polypropylene copolymer lowboy with spigot | ThermoFisher Scientific/VWR | 2324-0015 | Storing planaria water |
| Instant Ocean Sea Salt | Spectrum Brands | Amazon | Planaria water |
| Gentamicin Sulfate | Gemini Bio-products | 400-100P | Planaria water |
| Razor blades | Electron Microscopy Sciences | 71970 | Mincing liver |
| Disposable pastry bags-16”, 12 pack | Wilton | Amazon | Liver aliquots |
| 5 mL syringes | BD/VWR | 309647 | Liver aliquots |
| Petri dishes-35mm/60mm | Greiner Bio-One/VWR | 82050-536/82050-544 | |
| Plastic containers (various sizes) | Ziploc | Amazon | Housing planarians in static culture |
| Sodium Azide | Sigma | S2002 | |
| Transfer pipette | Globe Scientific | 138030 | |
| Forceps – Dumont Tweezer, Style 5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D (0203-5-PO) | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| DAPI | ThermoFisher | 62247 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate | ThermoFisher | S11223 | |
| Glycerol | Fisher BioReagents | BP229-1 |
References
- Tanaka, E. M., Reddien, P. W. The cellular basis for animal regeneration. Dev. Cell. 21, 172-185 (2011).
- Tanaka, E. M. The Molecular and Cellular Choreography of Appendage Regeneration. Cell. 165, 1598-1608 (2016).
- Curado, S., Stainier, D. Y. R., Anderson, R. M. Nitroreductase-mediated cell/tissue ablation in zebrafish: a spatially and temporally controlled ablation method with applications in developmental and regeneration studies. Nat. Protoc. 3, 948-954 (2008).
- White, D. T., Mumm, J. S. The nitroreductase system of inducible targeted ablation facilitates cell-specific regenerative studies in zebrafish. Methods. 62, 232-240 (2013).
- Smith-Bolton, R. K., Worley, M. I., Kanda, H., Hariharan, I. K. Regenerative growth in Drosophila imaginal discs is regulated by Wingless and Myc. Dev. Cell. 16, 797-809 (2009).
- Smith-Bolton, R. Drosophila Imaginal Discs as a Model of Epithelial Wound Repair and Regeneration. Adv. Wound Care. 5, 251-261 (2016).
- Newmark, P. A., Sánchez Alvarado, A. Not your father’s planarian: a classic model enters the era of functional genomics. Nat. Rev. Genet. 3, 210-219 (2002).
- Reddien, P. W., Sánchez Alvarado, A. Fundamentals of planarian regeneration. Annu. Rev. Cell Dev. Biol. 20, 725-757 (2004).
- Wagner, D. E., Wang, I. E., Reddien, P. W. Clonogenic neoblasts are pluripotent adult stem cells that underlie planarian regeneration. Science. 332, 811-816 (2011).
- Scimone, M. L., Kravarik, K. M., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Neoblast specialization in regeneration of the planarian Schmidtea mediterranea. Stem Cell Reports. 3, 339-352 (2014).
- van Wolfswinkel, J. C., Wagner, D. E., Reddien, P. W. Single-cell analysis reveals functionally distinct classes within the planarian stem cell compartment. Cell Stem Cell. 15, 326-339 (2014).
- Adler, C. E., Seidel, C. W., McKinney, S. A., Sánchez Alvarado, A. Selective amputation of the pharynx identifies a FoxA-dependent regeneration program in planaria. Elife. 3, e02238 (2014).
- Adler, C. E., Sánchez Alvarado, A. PHRED-1 is a divergent neurexin-1 homolog that organizes muscle fibers and patterns organs during regeneration. Dev. Biol. 427, 165-175 (2017).
- Wong, M. C., Martynovsky, M., Schwarzbauer, J. E. Analysis of cell migration using Caenorhabditis elegans as a model system. Methods Mol. Biol. 769, 233-247 (2011).
- Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C elegans chemotaxis assay. J. Vis. Exp. , e50069 (2013).
- Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. Laser microsurgery in Caenorhabditis elegans. Methods Cell Biol. 107, 177 (2012).
- Tasaki, J., Uchiyama-Tasaki, C., Rouhana, L. Analysis of Stem Cell Motility In Vivo Based on Immunodetection of Planarian Neoblasts and Tracing of BrdU-Labeled Cells After Partial Irradiation. Methods Mol. Biol. 1365, 323-338 (2016).
- Roberts-Galbraith, R. H., Brubacher, J. L., Newmark, P. A. A functional genomics screen in planarians reveals regulators of whole-brain regeneration. Elife. 5, (2016).
- Arnold, C. P., et al. Pathogenic shifts in endogenous microbiota impede tissue regeneration via distinct activation of TAK1/MKK/p38. Elife. 5, (2016).
- Pearson, B. J., et al. Formaldehyde-based whole-mount in situ hybridization method for planarians. Dev. Dyn. 238, 443-450 (2009).
- LoCascio, S. A., Lapan, S. W., Reddien, P. W. Eye Absence Does Not Regulate Planarian Stem Cells during Eye Regeneration. Dev. Cell. 40, 381-391 (2017).
- Nishimura, K., et al. Regeneration of dopaminergic neurons after 6-hydroxydopamine-induced lesion in planarian brain. J. Neurochem. 119, 1217-1231 (2011).
- Wilson, D. F., Chance, B. Azide inhibition of mitochondrial electron transport. I. The aerobic steady state of succinate oxidation. Biochim. Biophys. Acta. 131, 421-430 (1967).
- Duncan, H. M., Mackler, B. Electron Transport Systems of Yeast: III. Preparation and properties of cytochrome oxidase. J. Biol. Chem. 241, 1694-1697 (1966).
- Buchan, J. R., Yoon, J. H., Parker, R. Stress-specific composition, assembly and kinetics of stress granules in Saccharomyces cerevisiae. J. Cell Sci. 124, 228-239 (2011).
- Cebrià, F. Organization of the nervous system in the model planarian Schmidtea mediterranea: An immunocytochemical study. Neurosci. Res. 61, 375-384 (2008).
- Shimoyama, S., Inoue, T., Kashima, M., Agata, K. Multiple Neuropeptide-Coding Genes Involved in Planarian Pharynx Extension. Zoolog. Sci. 33, 311-319 (2016).
- Ito, H., Saito, Y., Watanabe, K., Orii, H. Epimorphic regeneration of the distal part of the planarian pharynx. Dev. Genes Evol. 211, 2-9 (2001).
- Bueno, D., Espinosa, L., Baguñà, J., Romero, R. Planarian pharynx regeneration in tail fragments monitored with cell-specific monoclonal antibodies. Dev. Genes Evol. 206, 425-434 (1997).
- Hyman, L. . The invertebrates: Platyhelminthes and Rhynchocoela, the acoelomate Bilateria. , (1951).
