Un protocole pour l’extraction d’un chaperon périplasmique métaux de transition dans le cadre de ses partenaires de liaison autochtone et caractérisation biophysique de son contenu de substrat par x-ray fluorescence et radiometal l’absorption est présentée.
Nous démontrons une méthode évolutive pour la séparation du périplasme bactérienne du cytoplasme. Cette méthode est utilisée pour purifier une protéine périplasmique aux fins de la caractérisation biophysique et le transfert de substrat de mesure entre les compartiments périplasmiques et cytoplasmiques. Par soigneusement limiter le temps que le périplasme est séparé du cytoplasme, l’expérimentateur peut extraire la protéine d’intérêt et doser chaque compartiment individuel pour substrat sans contamination entraînée entre compartiments. Puis, la protéine extraite du fractionnement peut être davantage analysée pour déterminer la structure tridimensionnelle ou profils de liaison du substrat. Sinon, cette méthode peut être réalisée après incubation avec un radiotraceur pour déterminer l’absorption totale de pourcentage, en plus de la distribution du traceur (et donc en métal transport) à travers différents compartiments bactériennes. Expérimentation d’un radiotraceur peut aider à faire la différence entre un substrat physiologique et le substrat artéfactuelles, telles que celles causées par les mismetallation.
Fluorescence des rayons x permet de découvrir la présence ou l’absence de métal incorporation dans un échantillon, mais aussi de mesurer les changements qui peuvent survenir en métal incorporation en tant que produit des conditions de croissance, des conditions de purification, et/ou des conditions de cristallisation. X-ray fluorescence fournit également une mesure relative de l’abondance pour chaque métal, qui peut être utilisé pour déterminer le meilleur pic d’absorption d’énergie métal utilisation anormale collecte de données de diffusion des rayons x. Radiometal absorption peut servir en tant que méthode pour valider le caractère physiologique d’un substrat détecté par fluorescence de rayons x, mais aussi de soutenir la découverte de nouveaux substrats.
Chez les bactéries Gram-négatives, piscines cytoplasmiques des atomes de métaux de transition sont augmentés et reconstitués par membrane interne ABC (cassette ATP binding) les importateurs qui atténuent métal translocation à travers la membrane interne. Protéines a-1-fixation des substrats périplasmiques Cluster (SSPE) composent un groupe de chaperons qui lient les atomes métalliques directement et ferry pour leur passer le périplasme de les livrer aux apparentés ABC importateurs1. Autres Clusters de SSPE sont dédiés au transport de substrats comme métalliques chélatés (groupe A-2), glucides (groupes B et D-1) et acides aminés (groupes B, C, F-2 et F-4) ; Néanmoins, indépendamment de substrat, SSPE suivre un évolutivement conservée pince en c pli2. Le mécanisme proposé généralisé pour le transfert de substrat SBP comprend la c-clamp, subissant une série de contorsions qui ressemblent à une dionée attrape-mouche3. En règle générale, Cluster SSPE a-1 purifier sous forme holo (liés à des métaux), bien que l’étude de ces SSPE est limitée par la difficulté de générer apo (sans métal) formes de protéine pour expérimentation4. À ce jour, les stratégies visant à étudier l’apo Cluster SSPE a-1 ont été limitées à la mutagenèse, dialyse et une dénaturation partielle avec tétraacétique (EDTA) acide chélateur5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. données structurelles issues de ces expériences suggèrent que Cluster SSPE a-1 ne suit pas précisément le mécanisme de la dionée attrape-mouche. Actuellement absent de la littérature est une méthode de production apo SSPE a-1 Cluster in vivo à l’aide de partenaires de liaison physiologique.
Nous montrons pour la première fois à l’aide de fractionnement cellulaire pour purifier YfeA, une péritonite bactérienne spontanée a-1 grappe de Yersinia pestis, l’agent étiologique de la peste, qui a été convertie en forme apo par interaction avec son importateur physiologique de YfeBCDE ABC apparenté dans la cellule. Nous montrons Qu’yfea se présente sous la forme apo par spectroscopie de rayons x dispersive en énergie (EDS), également connu sous le nom de x-ray fluorescence. Nous démontrons également des fonctionnalités de YfeBCDE en combinant le fractionnement de cellules avec des études d’absorption de métaux radioactifs hautement sensible faire la distinction entre l’absorption des métaux à travers la membrane externe et importation de métal à travers la membrane interne. L’utilisation d’un traceur radioactif permet une détection de quantités de pg/L de métaux, nettement inférieurs à la limite de détection pour des techniques telles qu’inductif spectrométrie de masse de plasma (ICP-MS) ou spectroscopie d’absorption atomique (AAS). Cela permet une perturbation minimale du système à l’étude. En outre, les méthodes traditionnelles, souvent nécessitent de plus grands volumes d’échantillon, post-traitement supplémentaire et retournement plus longs, qui ne sont pas typiques pour des dosages de traceurs radioactifs. Ainsi, à l’aide d’un radiotraceur fournit une méthode pratique et simple pour surveiller la distribution métallique et absorption dans une cellule. Il reste à déterminer si une apo que cluster SBP a-1 a produit à l’aide de cette méthode retentissaient les observations structurales des pratiques actuelles utilisées pour générer la protéine apo.
Fractionnement de cellules est une méthode établie pour séparer les compartiments cellulaires dans le but implicit de sonder précisément leur contenu en isolement12. Fractionnement de cellules est couramment utilisé pour confirmer l’emplacement d’une molécule au cours du cycle cellulaire ou de mesurer l’activité d’un compartiment particulier13. Par exemple, l’activité de transport métalliques peut être dosée par sondage des compartiments cellulaires pour substrat métallique. Intégrant le fractionnement cellulaire permet la distinction et la comparaison entre l’absorption des métaux à travers la membrane externe et de transfert de métal à travers la membrane interne. Ces processus peuvent ensuite à son tour être mesurés au fil du temps. Dans le cas de purification des protéines, les méthodes les plus courantes de la lyse cellulaire et de la séparation des composants solubles de composants insolubles sont rupture mécanique (broyage, mélange), homogénéisation à haute pression (c.-à-d. pression Français cell press, cellule perturbateurs) et les fréquences ultrasoniques (i.e., sonication)14. Utilisation des fréquences ultrasoniques pour lyser les cellules est généralement mieux adaptée pour les petits volumes ; Cependant, sonication est connue pour produire une chaleur excessive qui peut dénaturer les protéines. Pour éviter de générer une chaleur excessive, les fréquences ultrasonores sont généralement appliqués dans des éclats courts séquentiels, qui peuvent prendre beaucoup de temps et par inadvertance de dégrader des molécules d’ADN en fragments plus petits. En outre, plusieurs sondes de sonication cher peuvent être nécessaires pour les expériences analytiques et préparatives, comme chaque sonde a une portée limitée pour le volume de l’échantillon qui peut être traitée. Utilisation de haute pression à lyser les cellules évite générant une chaleur excessive lors de la lyse cellulaire par refroidissement des composants de presse de cellules de pression Français avant la lyse et de faire fonctionner un perturbateur de la cellule dans un milieu froid comme une chambre froide. Comme sondes de sonication, plusieurs ensembles de composants de presse Français pression cellulaires doive être acheté pour traiter un large éventail de volumes d’échantillon. Presse de cellule de pression Français assemblées sont facile à connecter, mais difficiles à utiliser et à nettoyer, peut être lourd à bouger et ont tendance à partir d’échantillons denses. Avantages à utiliser les fréquences ultrasonores et anticyclones à lyser les cellules comprennent la récupération de l’échantillon élevé, capable de traiter des échantillons multiples avec un minimum de contamination croisée, et réglable, force de cisaillement, qui peut être adapté pour l’optimisation de la lyse de une large gamme de types d’échantillons. Optimisation peut se produire en réglant la fréquence ultrasonique, durée des rafales, livres de pression du piston par pouce carré (lb/po2) et le nombre de passes par voie de presse. Utilisation de rupture mécanique à lyser les cellules pourrait être la stratégie plus techniquement triviale et moins coûteuse pour la lyse cellulaire. Rupture mécanique peut présenter des défis dans la récupération de l’échantillon et n’est pas idéal pour le traitement des échantillons multiples. Rupture mécanique est plus douce aux échantillons à haute pression ou des fréquences ultrasoniques, mais n’est pas un débit élevé et est sujette à la lyse inefficace. Inconvénient expérimentale de rupture mécanique, homogénéisation à haute pression et fréquences ultrasonores, est la perturbation incontrôlable de l’architecture cellulaire entière telle qu’après lyse, tous les composants de cellules aqueuses sont mélangés ensemble. En outre, tous les compartiments de la cellule ne perturbent pas en même temps ; contenu des compartiments qui lysent au début peut donc s’avérer soumis à des forces perturbatrices en cours plus de contenu de compartiments qui lysent tardif. Fractionnement de cellules permet techniquement simple, peu coûteuse et efficace axée sur le compartiment de séparation du contenu des cellules tout en évitant la nécessité d’équipements coûteux et exposition d’échantillon aux forces dures, perturbateurs.
Dans le cas de la SBP, substrat importé est réintroduite à potentiellement la protéine apo et régénère holo protéines lors de la lyse, avant chromatographie en aval ou d’autres techniques de purification. Inclusion de chélateur EDTA lors de la lyse présente un obstacle supplémentaire, où affinité métallique dans un premier temps de purification des protéines n’est pas possible car EDTA sera bande métallique de la résine de chromatographie et empêcher la protéine liant le15. Une solution simple et peu coûteuse est fractionnement cellulaire par choc osmotique, où centrifugation différentielle et réactifs de laboratoire courants permettent au chercheur de soigneusement extrait protéique suffisante pour l’analyse fonctionnelle. Fractionnement d’un choc osmotique utilise une évolution en deux étapes la pression osmotique pour séparer les compartiments cellulaires. Tout d’abord, un tampon hypertonique provoque des cellules à crénelées comme l’eau quitte chaque cellule et Deuxièmement, un tampon hypotonique entraîne des cellules à gonfler comme l’eau rentre dans chaque cellule. En contrôlant soigneusement pendant combien de temps les cellules gonflent, les membranes externes peuvent être sélectivement lysées (due à une accumulation de pression osmotique de l’arrivée d’eau), donc de vider leur contenu dans la mémoire tampon. Préservation des membranes internes s’assure que le contenu cytoplasmique est conservé en sphéroplastes et est facilement séparé du contenu périplasmique par centrifugation.
YfeA est un polyspécifiques SBP capable de lier le fer, manganèse et zinc atomes16. Les proportions relatives de métal constituée peut être modifiée selon métal supplémentation durant la croissance et dosés par fluorescence des rayons x comme est disponibles à l’Advanced Photon Source16 de Argonne National Laboratory. Fluorescence des rayons x permet au chercheur de profil rapidement une large Assemblée de métaux sans besoin de grandes ou cristaux de diffraction de qualité et peut même glaner des données d’une solution protéique précipitée ou protéiques.
Fluorescence des rayons x peut rapidement révéler des résultats inattendus tels que, dans ce cas, le substrat de YfeA primaire en zinc et non pas les substrats physiologiques documentée fer ou manganèse16. Si utilisé avant de recueillir des données de diffusion des rayons x, fluorescence x peut aviser le chercheur dans une conception expérimentale, par exemple, lesquelles énergie métal arête pour utiliser anormale collecte de données de diffusion des rayons x. Tout aussi utiles comme déterminant l’abondance relative d’une métal, x-ray fluorescence peut également déterminer si un métal est absent dans un échantillon, fournissant une méthode rapide pour séparer les cristaux contenant la protéine apo de protéine holo et estimation des métaux force du signal sans nécessiter beaucoup de temps de traitement des données. En identifiant un échantillon avec un signal fort de métal, la longueur d’onde précise à utiliser pour la collecte de données anormale aux rayons x diffusion peut être déterminé par l’analyse de la dispersion anomale de multiples longueurs d’onde (MAD).
Ce protocole détaillé est destiné à aider les nouveaux expérimentateurs avec succès accomplir fractionnement cellulaire et faire une utilisation efficace du matériel source de rayonnement synchrotron pour profil teneur totale en métal et faire progresser l’étude des protéines liant les métaux.
Fractionnement de cellules est un outil utile pour sonder précisément le contenu d’un compartiment cellulaire et peut servir comme un outil utile pour l’extraction de petites molécules telles que les atomes métalliques, ainsi que des macromolécules comme les protéines. Il est à noter que le fractionnement cellulaire n’est pas une technique absolue et peut être sujette sans une attention particulière aux mélange/remise en suspension, la température d’incubation et temps d’incubation. Mélange incomplet peut entraîner la lyse membraneuse minime et donc négligeable fractionnement, fractionnement à la température ambiante peut provoquer la lyse rapide des deux membranes entraînant la contamination de la fraction périplasmique avec contenu cytoplasmique, et temps d’incubation prolongée peuvent également entraîner la lyse excessive et donc de contamination de la fraction. Un compromis raisonnable pour parvenir à la lyse de la membrane externe efficace et relativement complet (tout en préservant la membrane interne) est de 20 minutes d’incubation sur la glace dans le tampon de fractionnement hypotonique. Une autre considération est la méthode d’extraction, où extraction dure en secouant ou en vortex susceptibles de compromettre la qualité de l’extrait comme causant l’agrégation des protéines. Il est recommandé de mélanger doucement comme par spatule, inversion ou une aspiration de matériaux de haute qualité pour l’analyse en aval de maintenir à l’aide d’une pipette. Purification de fractionnement cellulaire préparative peut se produire avec une efficacité variable, comme en témoigne la Figure 1. Dans une expérience, YfeA a commencé à 8 % de la teneur en extraite périplasmique (Figure 1), tandis que dans une autre expérience, YfeA a commencé comme 17 % de la teneur périplasmique (Figure 1). Ces différences peuvent émaner de plusieurs raisons telles que les conditions d’expression variable (ajout d’EDTA pour les milieux de culture peut augmenter l’expression de gènes régulés par des mécanismes tels que la régulation de la fourrure du promoteur Yfe famine), l’utilisation répétée du surgelé stock permanent et l’erreur humaine. Plutôt que de régler les temps d’incubation, il est recommandé d’intensifier la préparation. Purification de la fraction du périplasme est recommandée d’inclure une élution gradient linéaire de l’étape chromatographique d’anion exchange. Une élution gradient étape est une stratégie d’élution les utilisations discrète et brusques changements dans la composition de la phase mobile (i.e., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, NaCl 150 mM, etc..). Une élution dégradée linéaire est une stratégie d’élution qui utilise un changement graduel dans mobile phase de composition (c.-à-d., 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, etc..). Un gradient d’étape est utile pour séparer les molécules qui ont des affinités différentes pour la phase stationnaire et une élution dégradée linéaire est utile pour séparer les molécules qui ont des affinités similaires pour la phase stationnaire. Dans le cas de purification de protéine avec aucune balise de purification artificiel (pour améliorer l’affinité pour la phase stationnaire) d’un compartiment cellulaire qui est riche en espèces de protéines uniques, une élution dégradée linéaire est recommandée de séparer des protéines de ne pas intérêt qui peut ont des affinités similaires à la phase stationnaire comme la protéine d’intérêt. Généralement, un rendement de 1 à 2 mg d’apo purifiée YfeA est attendu de chaque litre de culture exprimant le YfeA de ses endogène promoteur d’y. pestis .
Fluorescence x est une technique qui permet au chercheur de rapidement déterminer la teneur en métal dans un échantillon et informer l’enquêteur inattendue incorporation de métal qui serait par ailleurs inconnue. Bien que l’EDTA est inclus dans le tampon de fractionnement hypertonique pour enlever le métal libre ou faiblement associées à, YfeA dérivé de la fraction du périplasme peut contenir des protéines holo. Étant donné que le transport métallique est un processus dynamique, peut-être la teneur en protéines holo provient de YfeA qui n’a toujours pas donné sa cargaison à YfeBCDE. Il est à noter que la fluorescence x seulement mesure la teneur totale en métal et n’indique pas si métal est ordonnée dans un réseau cristallin, ou plus précisément liée à une protéine. Pour déterminer si le métal est ordonnée dans un réseau cristallin et/ou spécifiquement lié à une molécule de protéine, traitement et collecte de données de diffusion des rayons x est requise. Fluorescence des rayons x permet néanmoins, pour l’évaluation d’exemple rapide de la contamination par les métaux et/ou intégration de protéines résiduelles holo. Temps de rayonnement synchrotron est limité et il n’y a pas toujours le temps d’élaborer une stratégie de collecte de données de diffusion des rayons x sur chaque échantillon, fluorescence x est donc une technique précieuse pour nombreux cristaux de dépistage et de hiérarchiser pour lesquels des échantillons aux rayons x données de diffusion doivent être recueillies. En outre, fluorescence des rayons x permet la collecte de données provenant d’échantillons qui peuvent diffracter pas de rayons x. Tout en collectant des données de fluorescence de rayons x, tantôt le signal peut être très faible et les spectres résultants imprécis. Pour améliorer la puissance du signal, soit pour fluorescence x ou balayage MAD, envisagez d’augmenter la durée d’exposition et/ou diminuant le rayon x de faisceau atténuation. Lorsqu’un échantillon est identifié pour la collecte des données de diffusion des rayons x, il est recommandé de collecter des données de diffusion des rayons x sur une autre partie de l’échantillon à ce qui était auparavant de fluorescence des rayons x et MAD balayage pour minimiser les dommages de rayonnement, améliorer la qualité des données collection et minimiser le potentiel de réduction du signal anormal.
Détection des traceurs radioactifs requiert une quantité de nanomolaires de matériel ou moins, et l’utilisation de ces traceurs en tant qu’agents de suivi moléculaire fournit une méthode simple et très sensible des processus cellulaires de palpage. Le test de radiometal décrit ci-dessus peut être utilisé pour déterminer l’absorption totale des métaux, répartition entre les compartiments cellulaires, ainsi que les taux d’absorption. En effet, chaque instant de données nécessite un fractionnement de 40 minutes ; Cependant, que chaque instant est atteinte, cellules sont immédiatement granulées et incubés dans haute tampon salin (Figure 5étape 1). Des mesures de radiometal des médias, mis au rebut haute tampon salin (Figure 5étape 1) et les fractions périplasmiques et cytoplasmiques après (Figure 5étape 3) indiquent que l’incubation haute tampon salin élimine avec succès tous restant un métal libre associé qui persistait après la centrifugation initiale après avoir atteint le point de temps. La centrifugation initiale supprime la plupart (jusqu’à 80 %) du métal libre non associé et la centrifugation après que incubation dans le tampon de sel élevée supprime également supplémentaire restant métal libre non associé. N’importe quel métal libre identifiant persistant ne devrait pas influencer considérablement le transport métallique pendant le fractionnement de 40 minutes. L’influence de la fractionnement de 40 minutes sur transport intracellulaire du métal est une autre considération pour l’interprétation des données prudentes. Pratiquement le protocole entier de fractionnement se produit sur la glace, en dehors de la centrifugation 30 seconde entre les étapes. Temps de transport, des expériences de cours ont indiqué que maintenir les cellules à 4 ° C abroge transport métal20,21,22; en métal par conséquent, parce que les expériences se produit sur la glace, le fractionnement de 40 minutes ne devrait pas augmenter significativement les concentrations de métaux dans le périplasme du cytoplasme et les concentrations de métaux sont censées être représentant des points de temps au cours de laquelle les cellules ont été initialement centrifugalized.
Détermination de l’absorption relative dans les différents compartiments cellulaires peut aider à informer les données XFS, confirment le caractère physiologique d’un substrat ainsi que permettre au chercheur de sonder plus loin les détails moléculaires d’un mécanisme. Par exemple, ajout de mutagenèse génétique pour des expériences d’absorption radiometal fournit une méthode directe pour renforcer les résidus fonctionnels clés ou molécules impliquées dans transport de substrat. Avantages des analyses et des expériences d’absorption radiometal sont rapide, haut débit, haute reproductibilité et parallélisation des expériences comparant les conditions de croissance et de constructions génétiques.
The authors have nothing to disclose.
Données ont également été prélevées à GM/CA@APS, qui a été financé en totalité ou en partie avec des fonds fédéraux de l’Institut National du Cancer (ACB-12002) et le National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006). Cette recherche a utilisé des ressources de l’Advanced Photon Source (APS), fonctionnant sur un bureau des installations de la Science utilisateurs US Department of Energy (DOE) pour l’Office of Science DOE par Argonne National Laboratory sous le contrat no. DE-AC02-06CH11357. Utilisation de l’Advanced Photon Source a été appuyée par l’u. s. Department of Energy Office of Science, de bureau de base Sciences de l’Energie, sous le contrat no. W-31-109-Eng-38.
Nous tenons à reconnaître l’UAB Comprehensive Cancer Center – Centre de Shared Mass Spectrometry/protéomique (P30CA13148-38) pour leur aide dans l’analyse par spectrométrie de masse.
C.D.R. a été financée par une subvention de l’Université d’Alabama à Birmingham Bureau de la diversité, l’équité et l’Inclusion. L.L.R. a été pris en charge par le service de radiologie de l’Université d’Alabama à Birmingham. Le ministère de l’énergie, Office of Science, Isotope programme appuyé 52production Mn et accorder des A.V.F.M. sous DESC0015773.
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |