अपने मूल बाध्यकारी भागीदारों के संदर्भ में एक periplasmic संक्रमण धातु निगरानी के निष्कर्षण के लिए एक प्रोटोकॉल, और एक्स-रे प्रतिदीप्ति और radiometal के द्वारा अपने सब्सट्रेट सामग्री के भौतिक लक्षण वर्णन प्रस्तुत किया है ।
हम कोशिका से बैक्टीरियल periplasm के जुदाई के लिए एक स्केलेबल विधि का प्रदर्शन । इस विधि के लिए भौतिक लक्षण वर्णन के प्रयोजन के लिए periplasmic प्रोटीन शुद्ध करने के लिए प्रयोग किया जाता है, और मापने सब्सट्रेट periplasmic और cytoplasmic डिब्बों के बीच स्थानांतरण । ध्यान से समय है कि periplasm कोशिका से अलग कर दिया है सीमित करके, प्रयोगकर्ता ब्याज और परख के प्रोटीन प्रत्येक डिब्बे के लिए अलग सब्सट्रेट के लिए ले-डिब्बों के बीच संक्रमण पर बिना निकाल सकते हैं । अंश से निकाली गई प्रोटीन फिर तीन आयामी संरचना निर्धारण या सब्सट्रेट-बाध्यकारी प्रोफाइल के लिए विश्लेषण किया जा सकता है । वैकल्पिक रूप से, इस विधि एक ट्रेसर के साथ गर्मी के बाद किया जा सकता है के लिए कुल प्रतिशत का निर्धारण, साथ ही साथ अनुरेखक के वितरण (और इसलिए धातु परिवहन) अलग बैक्टीरियल डिब्बों में । एक ट्रेसर के साथ प्रयोग एक शारीरिक सब्सट्रेट और artefactual सब्सट्रेट, जैसे mismetallation के कारण उन लोगों के बीच अंतर करने में मदद कर सकते हैं.
एक्स-रे प्रतिदीप्ति की उपस्थिति या एक नमूना में धातु निगमन के अभाव की खोज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही माप परिवर्तन है कि धातु निगमन में वृद्धि की स्थिति, शुद्धि शर्तों के उत्पाद के रूप में हो सकता है, और/ एक्स-रे प्रतिदीप्ति भी एक धातु है, जो सबसे अच्छा धातु ऊर्जा अवशोषण के लिए असंगत एक्स-रे कैटरिंग डाटा संग्रह के लिए उपयोग करने के लिए चोटी का निर्धारण किया जा सकता है के लिए बहुतायत के एक रिश्तेदार उपाय प्रदान करता है । Radiometal एक विधि के रूप में एक्स-रे प्रतिदीप्ति द्वारा पता लगाया सब्सट्रेट के शारीरिक प्रकृति को मान्य करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, साथ ही उपंयास सब्सट्रेट की खोज का समर्थन.
ग्राम में नकारात्मक बैक्टीरिया, संक्रमण धातु परमाणुओं की cytoplasmic पूल वृद्धि और भीतरी झिल्ली एबीसी द्वारा मंगाया जाता है (एटीपी-बाध्यकारी कैसेट) आयातकों कि भीतरी झिल्ली भर में धातु translocation के लये । Periplasmic क्लस्टर a-1 सब्सट्रेट-बाध्यकारी प्रोटीन (SBPs) chaperones के एक समूह है कि धातु परमाणुओं सीधे बांध और उंहें periplasm के माध्यम से नौका की रचना के लिए उंहें cognate एबीसी आयातक1उद्धार । SBPs के अंय समूहों chelated धातु (क्लस्टर ए-2), कार्बोहाइड्रेट (क्लस्टर्स बी और डी-1), और एमिनो एसिड (क्लस्टर बी, सी, एफ-2 और एफ-4) के रूप में, सब्सट्रेट के परिवहन के लिए समर्पित कर रहे हैं; फिर भी, सब्सट्रेट की परवाह किए बिना, SBPs एक evolutionarily-संरक्षित सी-क्लैंप2गुना का पालन करें । एसबीपी सब्सट्रेट स्थानांतरण के लिए सामान्यीकृत प्रस्तावित तंत्र में सी-क्लैंप contortions की एक श्रृंखला के दौर से गुजरना भी शामिल है जो एक वीनस मक्खियों3के समान है । आम तौर पर, क्लस्टर a-1 SBPs एक holo (धातु बंधे) के रूप में शुद्ध, हालांकि इन SBPs के अध्ययन के लिए प्रयोग4के लिए प्रोटीन के एपीओ (धातु मुक्त) रूपों पैदा करने में कठिनाई द्वारा सीमित है. तारीख करने के लिए, रणनीतियों के लिए एपीओ क्लस्टर ए-1 SBPs mutagenesis, डायलिसिस, और आंशिक विकार के लिए सीमित किया गया है के साथ ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) chelator5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. इन प्रयोगों से उत्पंन होने वाले संरचनात्मक डेटा का सुझाव है कि क्लस्टर A-1 SBPs शुक्र मक्खियों तंत्र का ठीक से पालन नहीं कर सकता है । वर्तमान में साहित्य से लापता एपीओ क्लस्टर ए-1 SBPs vivo में शारीरिक बाध्यकारी भागीदारों का उपयोग कर के उत्पादन की एक विधि है ।
हम पहली बार के लिए सेल आंशिक YfeA शुद्ध करने के लिए प्रदर्शन, एक क्लस्टर ए-1 एसबीपी से Yersinia pestis, प्लेग के etiological एजेंट है, जो अपने शारीरिक cognate YfeBCDE एबीसी आयातक के साथ बातचीत के माध्यम से एपीओ रूप में परिवर्तित किया गया था कक्ष में । हम दिखाने के YfeA के एपीओ रूप में है ऊर्जा प्रसार एक्स-रे स्पेक्ट्रोस्कोपी (), भी एक्स के रूप में जाना जाता रे प्रतिदीप्ति । हम भी आंतरिक झिल्ली भर में बाहरी झिल्ली और धातु आयात भर में धातु के बीच भेद करने के लिए अत्यधिक संवेदनशील रेडियोधर्मी धातु के अध्ययन के साथ सेल भिन्नीकरण के संयोजन से YfeBCDE कार्यक्षमता का प्रदर्शन । एक रेडियोधर्मी अनुरेखक के उपयोग की अनुमति देता है स्नातकोत्तर का पता लगाने के लिए/एल धातुओं की मात्रा, बहुत कम की तकनीक के लिए पता लगाने की सीमा की तुलना में इस तरह के रूप में inductively मिलकर प्लाज्मा मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-MS) या परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (आस). इस प्रणाली के ंयूनतम गड़बड़ी के लिए अनुमति देता है अध्ययन किया जा रहा है । इसके अतिरिक्त, पारंपरिक सूचीबद्ध तरीकों अक्सर बड़ा नमूना मात्रा की आवश्यकता होती है, अतिरिक्त पोस्ट प्रसंस्करण, और लंबे समय के आसपास बारी है, जो ट्रेसर परख के लिए विशिष्ट नहीं हैं । इस प्रकार, एक ट्रेसर का उपयोग कर धातु वितरण की निगरानी और एक सेल के भीतर के लिए एक सुविधाजनक और सरल तरीका प्रदान करता है । यह निर्धारित किया जा करने के लिए यदि एक एपीओ क्लस्टर A-1 एसबीपी इस विधि का उपयोग कर उत्पादित वर्तमान प्रक्रियाओं को एपीओ प्रोटीन उत्पंन करने के लिए इस्तेमाल से संरचनात्मक टिप्पणियों गूंज जाएगा रहता है ।
सेल अंश विशेष रूप से12अलगाव में उनकी सामग्री की जांच के अंतर्निहित प्रयोजन के लिए सेलुलर डिब्बों को अलग करने के लिए एक स्थापित विधि है । सेल अंश आमतौर पर सेल चक्र के दौरान एक अणु के स्थान की पुष्टि करने के लिए या एक विशेष डिब्बे की गतिविधि को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है13. उदाहरण के लिए, धातु परिवहन गतिविधि धातु सब्सट्रेट के लिए सेलुलर डिब्बों की जांच द्वारा परख कर सकते हैं । कोशिका अंशों को एकीकृत करने से बाहरी झिल्ली और धातु के भीतर की झिल्ली में भेद और धातु के बीच तुलना में अंतर होता है । इन प्रक्रियाओं तो बारी में समय के साथ मापा जा सकता है । प्रोटीन शुद्धिकरण के मामले में, कोशिका lysis और अघुलनशील घटकों से घुलनशील घटकों की जुदाई का सबसे आम तरीकों यांत्रिक व्यवधान (यानी, पीसने, सम्मिश्रण), उच्च दबाव homogenization (यानी, फ्रेंच दबाव सेल प्रेस, सेल व्यवधान), और अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों (अर्थात, sonication)14. लाइसे कोशिकाओं के लिए अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों का उपयोग आम तौर पर सबसे अच्छा छोटे संस्करणों के लिए अनुकूल है; हालांकि, sonication अत्यधिक गर्मी है कि प्रोटीन स्वभाव कर सकते है उत्पंन करने के लिए जाना जाता है । अत्यधिक गर्मी पैदा करने से बचने के लिए, अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों आमतौर पर अनुक्रमिक कम फटने में लागू कर रहे हैं, जो समय लेने वाले और अनजाने में छोटे टुकड़ों में डीएनए अणुओं नीचा हो सकता है । प्रत्येक जांच संसाधित किया जा सकता नमूना वॉल्यूम के लिए एक सीमित श्रेणी है के रूप में इसके साथ ही, एक से अधिक expensive sonication जांच preparative और विश्लेषणात्मक प्रयोगों के लिए आवश्यक हो सकता है । लाइसे कोशिकाओं को उच्च दबाव का उपयोग सेल lysis के दौरान अत्यधिक गर्मी पैदा करने से बचा जाता है द्रुतशीतन फ्रेंच दबाव सेल प्रेस घटकों से पहले lysis या एक ठंडे वातावरण में एक कोशिका अवरोधक ऑपरेटिंग ऐसे ठंडे कमरे के रूप में । sonication जांच की तरह, फ्रेंच दबाव सेल प्रेस घटकों के कई सेट नमूना मात्रा की एक विस्तृत श्रृंखला की प्रक्रिया के लिए खरीदा जा करने के लिए आवश्यकता हो सकती है । फ्रेंच दबाव सेल प्रेस विधानसभाओं से कनेक्ट करने के लिए आसान कर रहे हैं, लेकिन संचालित करने के लिए अजीब और साफ, स्थानांतरित करने के लिए भारी हो सकता है और घने नमूनों से कॉलेस्ट्रॉल के लिए प्रवण हैं अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों और लाइसे कोशिकाओं के लिए उच्च दबाव प्रणालियों का उपयोग करने के लिए लाभ उच्च नमूना वसूली, न्यूनतम पार संदूषण के साथ कई नमूनों की प्रक्रिया करने की क्षमता, और समायोज्य कतरनी बल, जो की lysis अनुकूलन के लिए अनुकूलित किया जा सकता शामिल नमूना प्रकार की एक विस्तृत श्रृंखला । अल्ट्रासोनिक आवृत्ति, फटने की अवधि, वर्ग इंच (साई) प्रति पिस्टन दबाव पाउंड, और प्रेस के माध्यम से गुजरता की संख्या का समायोजन करके अनुकूलन हो सकता है । लाइसे कोशिकाओं को यांत्रिक विघटन का उपयोग सेल lysis के लिए सबसे अधिक तकनीकी रूप से तुच्छ और कम खर्चीली रणनीति हो सकती है । यांत्रिक व्यवधान नमूना वसूली में चुनौतियों मौजूद कर सकते हैं और कई नमूनों प्रसंस्करण के लिए आदर्श नहीं है । यांत्रिक व्यवधान उच्च दाब या अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों से नमूनों के लिए gentler है, लेकिन उच्च प्रवाह नहीं है और अकुशल lysis के लिए प्रवण है । यांत्रिक विघटन, उच्च दाब homogenization, और अल्ट्रासोनिक आवृत्तियों की एक महत्वपूर्ण प्रयोगात्मक सीमा, इस तरह के lysis के बाद पूरे सेलुलर वास्तुकला के बेकाबू व्यवधान है, सभी जलीय कोशिका घटकों मिश्रित कर रहे हैं साथ. इसके अलावा, सभी सेल डिब्बों को एक ही समय में बाधित नहीं करते; इसलिए, डिब्बों की सामग्री है कि जल्दी लाइसे चल विघटनकारी अब लाइसे देर से डिब्बों की सामग्री से अधिक बलों के अधीन किया जा सकता है । सेल विभाजन सस्ती के लिए अनुमति देता है, तकनीकी रूप से सरल, कुशल डिब्बे सेल सामग्री की जुदाई आधारित है, जबकि महंगे उपकरण और कठोर, विघटनकारी बलों के लिए नमूना जोखिम के लिए आवश्यकता से परहेज ।
एसबीपी के मामले में, आयातित सब्सट्रेट संभावित एपीओ प्रोटीन को पुनः शुरू किया जाता है और lysis के दौरान holo प्रोटीन पुनर्जीवित, बहाव क्रोमैटोग्राफी या अन्य शोधन तकनीक से पहले. lysis के दौरान EDTA chelator का समावेश एक अतिरिक्त बाधा, जहां प्रोटीन शुद्धि के एक पहले कदम के रूप में धातु संबध संभव नहीं है प्रस्तुत करता है क्योंकि EDTA धातु क्रोमैटोग्राफी राल से पट्टी और प्रोटीन15बाध्यकारी रोकने जाएगा । एक सरल और सस्ती समाधान परासरणी सदमे से सेल आंशिकता है, जहां अंतर केंद्रापसारक और आम प्रयोगशाला एजेंट अंवेषक को ध्यान से कार्यात्मक विश्लेषण के लिए पर्याप्त प्रोटीन निकालने के लिए सक्षम है । परासरणी शॉक भिंन सेलुलर डिब्बों को अलग करने के लिए परासरणी दबाव में एक दो कदम परिवर्तन का उपयोग करता है । सबसे पहले, एक hypertonic बफर कोशिकाओं crenate के रूप में पानी के रूप में प्रत्येक कोशिका पत्ते और दूसरे, एक hypotonic बफर कोशिकाओं को पानी के रूप में प्रफुल्लित करने का कारण बनता है फिर से प्रत्येक कोशिका में प्रवेश करती है । ध्यान से नियंत्रित करने से कितनी देर तक कोशिकाओं प्रफुल्लित, बाहरी झिल्ली चुन लीजड जा सकता है (आने वाले पानी से परासरणी दबाव के buildup के कारण), इस प्रकार बफर में उनकी सामग्री को खाली । भीतरी झिल्ली के संरक्षण सुनिश्चित करता है कि cytoplasmic सामग्री spheroplasts में बनाए रखे हैं, और आसानी से periplasmic सामग्री से केंद्रापसारक द्वारा अलग कर रहे हैं ।
YfeA एक polyspecific एसबीपी बंधन लोहा, मैंगनीज, और जस्ता परमाणुओं में सक्षम है16। शामिल धातु के सापेक्ष अनुपात वृद्धि के दौरान धातु के पूरकता के अनुसार बदला जा सकता है, और एक्सरे प्रतिदीप्ति द्वारा परख जैसे Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला के उंनत फोटॉन स्रोत16में उपलब्ध है । एक्स-रे प्रतिदीप्ति अंवेषक जल्दी से बड़ी या विवर्तन गुणवत्ता क्रिस्टल के लिए आवश्यकता के बिना धातुओं की एक व्यापक विधानसभा प्रोफ़ाइल के लिए सक्षम बनाता है, और यहां तक कि प्रोटीन या proteinaceous समाधान से डेटा बटोरना कर सकते हैं ।
एक्स-रे प्रतिदीप्ति जल्दी से इस तरह के रूप में अप्रत्याशित परिणाम प्रकट कर सकते हैं, इस मामले में, प्राथमिक YfeA सब्सट्रेट जस्ता जा रहा है और नहीं प्रलेखित शारीरिक सब्सट्रेट आयरन या मैंगनीज16. एक्स-रे कैटरिंग डेटा एकत्रित करने से पहले उपयोग किया जाता है, तो एक्स-रे प्रतिदीप्ति प्रयोगात्मक डिजाइन में जांचकर्ता को सूचित कर सकते हैं, इस तरह के रूप में जो धातु ऊर्जा बढ़त (ओं) विषम एक्स-रे बिखरने डेटा संग्रह के लिए उपयोग करने के लिए. बस एक धातु के सापेक्ष बहुतायत निर्धारित करने के रूप में उपयोगी के रूप में, एक्स-रे प्रतिदीप्ति भी अगर एक धातु एक नमूना में अनुपस्थित है, holo प्रोटीन से एपीओ प्रोटीन युक्त क्रिस्टल को अलग करने की एक तेजी से विधि प्रदान करने का निर्धारण कर सकते हैं, और धातु संकेत शक्ति का आकलन समय लेने वाली डेटा प्रोसेसिंग की आवश्यकता के बिना । एक मजबूत धातु संकेत के साथ एक नमूना की पहचान करने पर, असंगत एक्स-रे के लिए उपयोग करने के लिए सटीक तरंग दैर्ध्य डेटा संग्रह एकाधिक-तरंग दैर्ध्य विषम फैलाव (MAD) स्कैन द्वारा निर्धारित किया जा सकता है ।
इस विस्तृत प्रोटोकॉल को सफलतापूर्वक सेल भिंन प्रदर्शन और सिंक्रोट्रॉन beamline हार्डवेयर का प्रभावी उपयोग प्रोफ़ाइल कुल धातु सामग्री के लिए और धातु बाध्यकारी प्रोटीन के अध्ययन अग्रिम करने में मदद करने के लिए नए experimenters का इरादा है ।
सेल अंश विशेष रूप से एक सेलुलर डिब्बे की सामग्री की जांच के लिए एक उपयोगी उपकरण है, और ऐसे धातु परमाणुओं के रूप में छोटे अणुओं को निकालने के लिए एक उपयोगी उपकरण के रूप में सेवा कर सकते हैं, साथ ही अणुओं जैसे प्रोटीन । यह ध्यान देने योग्य है कि कोशिका भिन्नीकरण एक निरपेक्ष तकनीक नहीं है और मिश्रण करने के लिए सावधान ध्यान के बिना प्रवण त्रुटि हो सकता है लायक है/ अधूरा मिश्रण न्यूनतम झिल्लीदार lysis में परिणाम कर सकते हैं और इस प्रकार नगण्य भिन्नीकरण, कमरे के तापमान पर आंशिक cytoplasmic सामग्री के साथ periplasmic अंश के संदूषण में जिसके परिणामस्वरूप दोनों झिल्ली की तेजी से lysis पैदा कर सकता है, और विस्तारित गर्मी बार भी अत्यधिक lysis में परिणाम कर सकते है और इस प्रकार भिंन संदूषण । कुशल और अपेक्षाकृत पूरा बाहरी झिल्ली lysis प्राप्त करने के लिए एक उचित समझौता (जबकि भीतरी झिल्ली के संरक्षण) hypotonic अंश बफर में बर्फ पर 20 मिनट की मशीन है । एक और विचार निष्कर्षण की विधि है, जहां मिलाते हुए या भंवर से कठोर निष्कर्षण इस तरह के प्रोटीन एकत्रीकरण के कारण के रूप में निकालने की गुणवत्ता समझौता सकता है । यह पिपेट द्वारा रंग, उलटा या aspirating के रूप में धीरे मिश्रण करने के लिए अनुप्रवाह विश्लेषण के लिए उच्च गुणवत्ता सामग्री बनाए रखने के लिए सिफारिश की है । preparative सेल भिन्नीकरण से शुद्धि के रूप में चर क्षमता के साथ हो सकता है चित्रा 1द्वारा सबूत । एक प्रयोग में, YfeA निकाले periplasmic सामग्री (चित्रा 1C) के 8% के रूप में शुरू हुआ, जबकि एक और प्रयोग में, YfeA periplasmic सामग्री (चित्रा 1 डी) के 17% के रूप में शुरू हुआ । इन मतभेदों को ऐसे चर अभिव्यक्ति की स्थिति के रूप में कई कारणों से उत्पंन कर सकते है (विकास मीडिया को जोड़ने के लिए EDTA Yfe प्रमोटर के फर विनियमन के रूप में भुखमरी तंत्र द्वारा विनियमित जीन की अभिव्यक्ति में वृद्धि कर सकते हैं), जमे हुए का उपयोग दोहराया स्थाई स्टॉक, और मानव त्रुटि । के बजाय मशीन समय समायोजन, यह पैमाने पर तैयारी की सिफारिश की है । periplasm अंश से शुद्धि आयनों विनिमय क्रोमेटोग्राफिक कदम से एक रैखिक ढाल रेफरेंस शामिल करने के लिए सिफारिश की है । एक कदम ढाल रेफरेंस एक रेफरेंस रणनीति का उपयोग करता है असतत और अचानक मोबाइल चरण संरचना में परिवर्तन (यानी, 0 mm NaCl, ५० mm NaCl, १५० mm NaCl, etc.) । एक रैखिक ढाल रेफरेंस एक रेफरेंस रणनीति है कि मोबाइल चरण संरचना में क्रमिक परिवर्तन का उपयोग करता है (यानी, 0 मिमी NaCl, 5 मिमी NaCl, 10 मिमी NaCl, आदि.). एक कदम ढाल अणुओं है कि स्थिर चरण के लिए विभिंन समानताएं है अलग करने के लिए उपयोगी है, और एक रैखिक ढाल रेफरेंस अणुओं है कि स्थिर चरण के लिए समान समानताएं है अलग करने के लिए उपयोगी है । कोई कृत्रिम शुद्धि टैग के साथ प्रोटीन शुद्ध करने के मामले में (स्टेशनरी चरण के लिए संबध को बढ़ाने के लिए) एक सेल डिब्बे कि अद्वितीय प्रोटीन प्रजातियों में समृद्ध है से, एक रैखिक ढाल रेफरेंस के लिए ब्याज की अलग प्रोटीन की सिफारिश की है कि हो सकता है ब्याज के प्रोटीन के रूप में स्थिर चरण के लिए समान समानताएं है । आम तौर पर, शुद्ध एपीओ YfeA के 1-2 मिलीग्राम की एक उपज संस्कृति के प्रत्येक लीटर से अपने अंतर्जात Y . pestis प्रमोटर से YfeA व्यक्त की उंमीद है ।
एक्स-रे प्रतिदीप्ति एक तकनीक है कि जांचकर्ता जल्दी से एक नमूना में धातु सामग्री का निर्धारण करने के लिए सक्षम बनाता है, और अप्रत्याशित धातु शामिल है कि अंयथा अज्ञात होगा के बारे में जांचकर्ता को सूचित करें । हालांकि EDTA hypertonic आंशिकीकरण बफर में शामिल करने के लिए ढीला-संबद्ध या मुक्त धातु, YfeA periplasm अंश से व्युत्पंन कुछ holo प्रोटीन शामिल कर सकते है हटा दिया जाता है । यह देखते हुए कि धातु परिवहन एक गतिशील प्रक्रिया है, शायद holo प्रोटीन सामग्री YfeA है कि अभी भी YfeBCDE के लिए अपने माल दान नहीं किया है से उत्पंन । यह ध्यान देने योग्य बात है कि एक्स-रे प्रतिदीप्ति केवल कुल धातु सामग्री के उपाय और संकेत नहीं है अगर धातु एक क्रिस्टल जाली, या विशेष रूप से एक प्रोटीन के लिए बाध्य में आदेश दिया है लायक है । धातु एक क्रिस्टल जाली में आदेश दिया है और/या विशेष रूप से एक प्रोटीन अणु के लिए बाध्य है, तो यह निर्धारित करने के लिए, एक्स-रे कैटरिंग डेटा संग्रह और प्रसंस्करण की आवश्यकता है । फिर भी, एक्स-रे प्रतिदीप्ति धातु संदूषण और/या अवशिष्ट holo प्रोटीन एकीकरण के त्वरित नमूना आकलन के लिए अनुमति देता है । सिंक्रोट्रॉन विकिरण समय सीमित है और वहाँ हमेशा हर नमूने पर एक्स-रे बिखरने डेटा इकट्ठा करने के लिए एक रणनीति ईजाद करने के लिए समय नहीं है, इस प्रकार एक्स-रे प्रतिदीप्ति कई क्रिस्टल स्क्रीनिंग और प्राथमिकता के लिए एक मूल्यवान तकनीक है जिसके लिए नमूने एक्स-रे कैटरिंग डेटा एकत्रित किया जाना चाहिए । इसके अलावा, एक्स-रे प्रतिदीप्ति नमूने है कि एक्स-रे diffract नहीं हो सकता से डेटा संग्रह सक्षम बनाता है । जबकि एक्स-रे प्रतिदीप्ति डेटा का संग्रह, कई बार संकेत बहुत कमजोर हो सकता है और जिसके परिणामस्वरूप स्पेक्ट्रा जानकारीपूर्ण । सिग्नल की ताकत में सुधार करने के लिए, या तो एक्स-रे प्रतिदीप्ति या पागल स्कैनिंग के लिए, जोखिम समय बढ़ाने पर विचार और/या एक्स-रे बीम क्षीणन कम । एक नमूना एक्स-रे बिखरने डेटा इकट्ठा करने के लिए पहचान की है, यह एक्स-रे प्रतिदीप्ति और विकिरण क्षति को कम करने के लिए पागल स्कैनिंग के लिए इस्तेमाल किया गया था से नमूना के एक अलग भाग पर एक्स-रे बिखरने डेटा इकट्ठा करने के लिए सिफारिश की है, डेटा की गुणवत्ता में सुधार संग्रह, और असंगत संकेत की कमी के लिए किसी भी क्षमता को कम ।
रेडियोधर्मी अनुरेखकों का पता लगाने की आवश्यकता है nanomolar मात्रा या कम सामग्री, और आणविक ट्रैकिंग एजेंटों के रूप में इन अनुरेखकों का उपयोग सेलुलर प्रक्रियाओं की जांच की एक सरल और अत्यधिक संवेदनशील विधि प्रदान करता है. ऊपर उल्लिखित radiometal परख के लिए कुल धातु का निर्धारण, सेलुलर डिब्बों में वितरण, साथ ही साथ की दरें निर्धारित किया जा सकता है । दरअसल, प्रत्येक डेटा समय बिंदु एक ४० मिनट भिन्नीकरण की आवश्यकता है; हालांकि, के रूप में हर समय बिंदु तक पहुंच गया है, कोशिकाओं को तुरंत गोली और उच्च नमक बफर में मशीन है (चित्रा 5, चरण 1) । मीडिया के Radiometal माप, उच्च नमक बफर छोड़ दिया (चित्रा 5, चरण 1), और periplasmic और cytoplasmic अंशों के बाद (चित्रा 5, चरण 3) उच्च नमक बफर मशीन सफलतापूर्वक सभी को हटा इंगित करता है शेष असंबद्ध मुक्त धातु है कि समय बिंदु तक पहुंचने के बाद शुरुआती केंद्रापसारक पीछा सुस्त । प्रारंभिक केंद्रापसारक हटाता है सबसे (अप करने के लिए ८०%) असंबद्ध मुक्त धातु, और उच्च नमक बफर में गर्मी के बाद केंद्रापसारक भी अतिरिक्त शेष असंबद्ध मुक्त धातु निकालता है । किसी भी सुस्ती असंबद्ध मुक्त धातु काफी ४० मिनट अंश के दौरान धातु परिवहन को प्रभावित करने की उम्मीद नहीं है. intracellular धातु परिवहन पर ४० मिनट के अंश का प्रभाव विवेकपूर्ण डेटा व्याख्या के लिए एक और विचार है । लगभग पूरे अंश प्रोटोकॉल बर्फ पर होता है, इसके अलावा कदम के बीच 30 दूसरा केंद्रापसारक से । धातु परिवहन समय पाठ्यक्रम प्रयोगों कि 4 ° c abrogates धातु परिवहन20,21,22पर कोशिकाओं को बनाए रखने का संकेत दिया है; इसलिए, क्योंकि प्रयोगों बर्फ पर होता है, ४० मिनट अंश काफी कोशिका के periplasm में धातु के स्तर को बढ़ाने के लिए उम्मीद नहीं है और धातु के स्तर पर समय बिंदुओं के प्रतिनिधि होने की उम्मीद कर रहे हैं, जिस पर कोशिकाओं थे शुरू में centrifugalized.
अलग सेलुलर डिब्बों में रिश्तेदार का दृढ़ संकल्प XFS डेटा को सूचित करने में मदद कर सकते हैं, एक सब्सट्रेट के शारीरिक प्रकृति पुष्टि के रूप में अच्छी तरह के रूप में एक तंत्र के आणविक विवरण आगे जांच करने के लिए अन्वेषक सक्षम. उदाहरण के लिए, आनुवंशिक mutagenesis के अतिरिक्त radiometal के लिए प्रयोगों के लिए एक सीधा तरीका प्रमुख कार्यात्मक अवशेषों या सब्सट्रेट परिवहन में शामिल अणुओं को सुदृढ़ करने के लिए प्रदान करता है । radiometal का लाभ उठाएं प्रयोगों और विश्लेषणों में तेजी से बदलाव, उच्च प्रवाह, उच्च reproducibility, और विकास की स्थिति और आनुवंशिक निर्माण की तुलना प्रयोगों के parallelization शामिल हैं ।
The authors have nothing to disclose.
डेटा भी जीएम/CA @ ए. पी., जो पूरे में या राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (एसीबी-१२००२) और राष्ट्रीय जनरल चिकित्सा विज्ञान संस्थान (एजीएम-१२००६) से संघीय धन के साथ भाग में वित्त पोषित किया गया है पर एकत्र किए गए । इस शोध के संसाधनों का इस्तेमाल उंनत फोटॉन स्रोत (ए पी एस), अमेरिका के एक ऊर्जा विभाग (डो) कार्यालय विज्ञान प्रयोक्ता सुविधा के Argonne राष्ट्रीय प्रयोगशाला द्वारा विज्ञान के डो कार्यालय के लिए संचालित के तहत अनुबंध सं । DE-AC02-06CH11357 । उंनत फोटॉन स्रोत का उपयोग अमेरिका के ऊर्जा विभाग, विज्ञान के कार्यालय, बेसिक ऊर्जा विज्ञान के कार्यालय, अनुबंध सं के अंतर्गत द्वारा समर्थित किया गया । डब्ल्यू-31-109-अभियांत्रिकी-३८ ।
हम जन स्पेक्ट्रोमेट्री विश्लेषण में उनकी सहायता के लिए UAB व्यापक कैंसर केंद्र-मास स्पेक्ट्रोमेट्री/प्रोटियोमिक् साझा सुविधा (P30CA13148-38) को स्वीकार करना चाहेंगे ।
C.D.R. विविधता, इक्विटी, और शामिल किए जाने के बर्मिंघम कार्यालय में अलबामा के विश्वविद्यालय से एक अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था । L.L.R. बर्मिंघम में अलबामा के विश्वविद्यालय के रेडियोलॉजी विभाग द्वारा समर्थन किया गया था । ऊर्जा विभाग, विज्ञान के कार्यालय, आइसोटोप कार्यक्रम अनुदान DESC0015773 के तहत ५२Mn उत्पादन और A.V.F.M. का समर्थन किया.
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |