Ett protokoll för utvinning av en periplasmic övergång metall förkläde i samband med dess infödda bindande partner och biofysiska karakterisering av dess substrat tillfredsställer av X-ray fluorescens och radiometal upptag presenteras.
Vi visar en skalbar metod för separation av den bakteriella periplasm från cytoplasman. Denna metod används för att rena periplasmic protein för biofysiska karakterisering, och åtgärden substrat överlämning mellan periplasmic och cytoplasmiska fack. Genom att noggrant begränsa den tid som periplasm avskiljs från cytoplasman, kan försöksledaren extrahera proteinet av intresse och assay varje fack individuellt för grundmaterial utan överföring kontaminering mellan fack. Extraherade proteinet från fraktionering kan sedan analyseras ytterligare för tredimensionella strukturbestämning eller substrat-bindande profiler. Denna metod kan alternativt utföras efter inkubation med en radiotracer att fastställa totala procent upptag, samt distribution av spårämne (och därmed metall transport) över olika bakteriella fack. Experiment med en radiotracer kan hjälpa till att skilja mellan ett fysiologiska substrat och tingsliga substrat, såsom de som orsakas av mismetallation.
X-ray fluorescens kan användas för att upptäcka närvaron eller frånvaron av metall inkorporering i ett prov, samt mäta förändringar som kan uppstå i metall inkorporeringen som en produkt av tillväxt villkorar, rening villkor eller kristallisering villkor. X-ray fluorescens ger också ett relativt mått av överflöd för varje metall, som kan användas för att bestämma den bästa metalliska energi absorption toppen att använda för avvikande X-ray scattering datainsamling. Radiometal upptag kan användas som en metod för att validera fysiologiska beskaffenhet ett substrat som upptäcks av X-ray fluorescens, samt stödja upptäckten av nya substrat.
I gramnegativa bakterier, cytoplasmiska pooler av övergången belägger med metall atoms ökade och fylls på av inre membranet ABC (ATP-bindande kassett) importörer som mildra metall flyttning över det inre membranet. Periplasmic kluster A-1 substrat-bindande proteiner (SBPs) komponera en grupp av följeslagare som binder metallatomerna direkt och ferry dem genom periplasm att leverera dem till cognate ABC importörer1. Andra kluster av SBPs är avsedda för transport av substrat, såsom kelaterade metall (kluster a-2), kolhydrater (kluster B och d-1) och aminosyror (kluster B, C, f-2 och f-4); ändå, oavsett substrat, SBPs följa ett evolutionärt bevarade c-clamp fold2. Den generaliserade föreslagna mekanismen för SBP substrat överföring innehåller c-klämman som genomgår en rad krumbukter som liknar en Venus flugfälla3. I allmänhet renar kluster A-1 SBPs i holo (metall-bunden) form, men studien av dessa SBPs är begränsat av svårigheten att generera apo (metallfri) former av protein för experiment4. Hittills har strategier för att studera apo kluster A-1 SBPs begränsats till mutagenes, dialys och partiell denaturering med etylendiamintetraättiksyra syra (EDTA) kelator5,6,7,8 , 9 , 10 , 11. strukturella uppgifter som härrör från dessa experiment tyder på att klustret A-1 SBPs inte kanske exakt följer Venus flytrap mekanismen. För närvarande saknas i litteraturen är en metod för att producera apo kluster A-1 SBPs i vivo med fysiologiska bindande partner.
Vi visar för första gången använder cell fraktionering för att rena YfeA, en kluster A-1 SBP från Yersinia pestis, det etiologiska medlet av pesten, som omvandlades till formuläret apo genom samverkan med dess fysiologiska besläktat YfeBCDE ABC-importör i cellen. Vi visar YfeA i apo form av energi-dispersive X-ray spektroskopi (EDS), även känd som X-ray fluorescens. Vi visar också YfeBCDE funktionalitet genom att kombinera cell fraktionering med mycket känsliga radioaktiv metall upptag studier att skilja metall upptag över det yttre membranet och metall import över det inre membranet. Användning av ett radioaktivt spårämne tillåter för detektion av pg/L mängder metaller, mycket lägre än detektionsgränsen för tekniker sådan som induktivt kopplad plasma-masspektrometri (ICP-MS) eller atomabsorption spektroskopi (AAS). Detta möjliggör minimal störning av systemet som studeras. Dessutom kräver de traditionella metoderna ofta större provmängder, ytterligare efterbehandling och längre leveranstider, som inte är typiska för radiotracer analyser. Således, med hjälp av en radiotracer ger en bekväm och okomplicerad metod för övervakning av metall distribution och upptag inom en cell. Det återstår för att pröva om en apo kluster A-1 SBP som framställs med denna metod skulle echo strukturella observationerna från de aktuella metoder som används för att generera apo protein.
Cell fraktionering är en etablerad metod för att separera cellulära fack för det implicita syftet särskilt sondera deras innehåll i isolering12. Cell fraktionering används ofta för att bekräfta platsen för en molekyl under cellcykeln eller mäta aktiviteten av en särskild kupé13. Till exempel kan metall transportverksamhet analyseras genom sondering cellulära fack för metallsubstrat. Att integrera cell fraktionering gör åtskillnad och jämförelse mellan metall upptag över det yttre membranet och Metallöverföring över det inre membranet. Dessa processer kan sedan i sin tur mätas över tiden. När det gäller protein rening, de vanligaste metoderna för cell lysis och separation av lösliga komponenter från olösliga komponenter är mekaniska störningar (dvs, malning, blandning), högt tryck homogenisering (dvs franska tryck cell press, cell ämnen), och ultraljud frekvenser (dvs., ultraljudsbehandling)14. Användningen av ultraljud frekvenser att lysera celler passar generellt bäst för små volymer; ultraljudsbehandling är dock känt att generera hetta som kan denaturera proteiner. För att undvika genererar stark hetta, tillämpas normalt ultraljud frekvenser i sekventiella korta skurar, som kan vara tidskrävande och oavsiktligt försämra DNA-molekyler i mindre fragment. Dessutom kan flera dyra ultraljudsbehandling sonder krävas för preparativ och analytisk experiment, som varje sond har ett begränsat utbud för den provvolymen som kan bearbetas. Användning av högt tryck för att lysera celler undviker generera hetta under cellys genom kylning franska tryck cell press komponenter före Lys eller driver en cell disruptor i en kall miljö som ett kallt rum. Som ultraljudsbehandling sonder, kan flera uppsättningar av franska tryck cell press komponenter behöva köpas för att bearbeta ett brett utbud av provvolymer. Franska tryck cell press församlingar är lätt att ansluta men obekväma att använda och rengöra, kan vara tung att flytta och är benägna att igensättning från täta prover. Fördelar med att använda ultraljud frekvenser och högtrycks system för att lysera celler inkluderar höga samplingsfrekvenser återhämtning, förmåga att bearbeta flera prover med minimal korskontaminering, och justerbar klippning kraft, som kan anpassas för Lys optimering av ett brett utbud av provtyper. Optimering kan uppstå genom att justera ultraljud frekvensen, varaktigheten av skurar, kolv trycket pounds per kvadrattum (psi) och antalet passeringar genom pressen. Användning av mekaniska störningar att lysera celler kan vara den mest tekniskt trivialt och minst kostsamma strategin för cellys. Mekaniska störningar kan presentera utmaningar i provet återhämtning och är inte idealisk för bearbetning av flera prover. Mekaniska störningar är skonsammare att prover än högtryck eller ultraljud frekvenser, men är inte hög genomströmning och är benägna att ineffektiva lysis. En betydande experimentella begränsning av mekaniska störningar, högt tryck homogenisering och ultraljud frekvenser, är okontrollerbar störningar av hela cellulära arkitektur sådan att efter Lys, alla vattenhaltiga cell komponenterna blandas tillsammans. Dessutom stör alla cell fack inte på samma gång; innehållet i fack som lyse tidigt kan därför föremål för pågående störande krafter längre än innehållet i fack som lyse sent. Cell fraktionering möjliggör billiga, effektiva och tekniskt okomplicerad fack-baserade separation av cellinnehåll samtidigt undvika behovet av dyrbar utrustning och prov exponering för hårda, störande krafter.
När det gäller SBP, importerade substrat återinförs till potentiellt apo protein och regenererar holo protein under Lys, före nedströms kromatografi eller andra tekniker för rening. Införandet av EDTA kelator under Lys presenterar ytterligare hinder, där metall affinitet som ett första steg av protein rening inte är möjlig eftersom EDTA kommer remsor metall från kromatografi kådan och förhindra protein bindande15. En enkel och billig lösning är cell fraktionering av osmotiska chock, där differentiell centrifugering och gemensamma laboratoriereagenser aktivera utredaren att försiktigt extrahera tillräckligt protein för funktionell analys. Osmotiska chock fraktionering använder tredjeparts en två-stegs förändring i osmotiska trycket att separera cellulära fack. För det första en hyperton buffert gör cellerna till crenate när vattnet lämnar varje cell och för det andra en hypoton buffert orsakar celler att svälla som vatten in varje cell. Genom att noggrant kontrollera hur länge cellerna sväller, de yttersta membran kan vara selektivt lyserat (på grund av ackumulering av osmotiska trycket från inkommande vattnet), således tömma innehållet i bufferten. Bevarandet av de inre membran säkerställer att cytoplasmiska innehållet finns kvar i spheroplasts, och är lätt separeras från periplasmic innehåll genom centrifugering.
YfeA är en polyspecifikt SBP kan bindande järn, mangan och zink atomer16. De relativa proportionerna av bolagiserade metall kan ändras enligt metall tillskott under tillväxt och analyseras av X-ray fluorescens som finns vid Argonne National Laboratory’s Advanced Photon Source16. X-ray fluorescens gör det möjligt för utredaren att snabbt profilera en bred sammansättning av metaller utan behov av stora eller diffraktion kvalitet kristaller, och kan även få fram data från protein fällning eller proteinhaltiga lösning.
X-ray fluorescens kan snabbt avslöja oväntade resultat såsom i detta fall den primära YfeA substrat som zink och inte dokumenterade fysiologiska substrat järn eller mangan16. Om används framför X-ray scattering datainsamling, kan X-ray fluorescens informera utredaren i experimentell design, till exempel vilka metall energi kanter om du vill använda för avvikande X-ray scattering datainsamling. Lika användbar som att bestämma det relativa överflödet av en metall, X-ray fluorescens kan också avgöra om en metall är frånvarande i ett prov, vilket är en snabb metod att separera kristaller innehållande apo protein från holo protein och uppskatta metall signalstyrka utan behov av tidskrävande databehandling. På att identifiera ett prov med en stark metall signal, kan exakta våglängden för avvikande X-ray scattering datainsamling bestämmas av multipel-våglängd avvikande dispersion (MAD) scan.
Detta detaljerade protokoll är avsett att hjälpa nya praktiker framgångsrikt utföra cell fraktionering och göra effektiva användningen av synkrotron beamline hårdvara att profilera totala metallinnehållet och främja studiet av metall-bindande proteiner.
Cell fraktionering är ett användbart verktyg för specifikt avsökning av innehållet i ett mobilfack, och kan fungera som ett användbart verktyg för att extrahera små molekyler som metallatomerna, liksom makromolekyler som proteiner. Det är värt att notera att cellen fraktionering är inte en absolut teknik och kan vara felbenägen som utan noggrann uppmärksamhet på blandning/resuspension, inkubation temperatur och inkubationstiden. Ofullständig blandning kan resultera i minimal membranös lysis och därmed försumbar fraktionering, fraktionering vid rumstemperatur kan orsaka snabb lys av båda hinnor kontaminering av den periplasmic fraktionen med cytoplasmiska tillfredsställer, och utökade inkubationstider kan också leda till överdriven lysis och därmed bråkdel kontaminering. En rimlig kompromiss för att uppnå effektiv och relativt komplett yttre membran Lys (samtidigt som det inre membranet) är 20 minuters inkubering över is i hypoton fraktionering bufferten. Ett annat övervägande är metoden för utvinning, där hård extraktion genom skakning eller virvel kan äventyra kvaliteten på extraktet som orsakar protein aggregering. Det rekommenderas att blanda försiktigt såsom av spatel, inversion eller aspirering av pipetten att upprätthålla hög kvalitet material för efterföljande analys. Rening från preparativ cell fraktionering kan uppstå med varierande effektivitet vilket framgår av figur 1. I ett experiment, YfeA började som 8% av det extraherade periplasmic innehållet (figur 1 c), medan i ett annat experiment, YfeA började som 17% av halten periplasmic (figur 1 d). Dessa skillnader kan uppkomma flera skäl såsom variabel uttrycket villkor (lägga till EDTA till tillväxt medier kan öka uttrycket av gener som regleras av svält mekanismer såsom päls reglering av promotorn Yfe), upprepad användning av frysta permanenta bestånd och mänskliga fel. I stället för att justera inkubationstider, rekommenderas det att skala upp preparatet. Rening från den periplasm fraktionen rekommenderas att inkludera en linjär övertoning eluering från anjon exchange kromatografiska steg. Ett steg gradient eluering är en eluering strategi använder diskret och plötsliga förändringar i mobil fas sammansättning (dvs., 0 mM NaCl, 50 mM NaCl, 150 mM NaCl, etc.). En linjär övertoning eluering är en eluering strategi som använder gradvis förändring i mobil fas sammansättning (dvs. 0 mM NaCl, 5 mM NaCl, 10 mM NaCl, etc.). En steg-gradient är användbart för att separera molekyler som har olika tillhörighet för den stationära fasen och en linjär övertoning eluering är användbart för att separera molekyler som har liknande tillhörigheter för den stationära fasen. När det gäller renande protein med ingen konstgjord rening tagg (att öka affinitet för den stationära fasen) från en cell kupé som är rik på unik protein arter, rekommenderas en linjär övertoning eluering att separera proteiner av kapitalandelar som kan har liknande tillhörighet till den stationära fasen som protein av intresse. Generellt, en avkastning på 1-2 mg renat apo YfeA förväntas från varje liter kultur uttrycker YfeA från dess endogena Y. pestis arrangören.
X-ray fluorescens är en teknik som gör att utredaren att snabbt avgöra metallinnehållet i ett prov, och informera utredaren om oväntade metall inkorporering som annars skulle vara okänd. Även om EDTA ingår i hyperton fraktionering bufferten att ta bort löst-associerade eller gratis metall, kan YfeA härstammar från den periplasm fraktionen innehålla vissa holo-protein. Med tanke på att metall transport är en dynamisk process, kanske härstammar holo proteinhalten från YfeA som fortfarande inte har donerat sin last till YfeBCDE. Det är värt att notera att X-ray fluorescens endast mäter totala metallinnehållet och anger inte om metall är beställt i ett kristallgitter, eller specifikt bundet till ett protein. För att avgöra om metall är beställt i ett kristallgitter och/eller specifikt bundet till en proteinmolekyl, krävs X-ray scattering datainsamling och bearbetning. Dock möjliggör X-ray fluorescens snabb prov bedömningen av metall förorening eller kvarstående holo protein integration. Synkrotronstrålning tid är begränsad och det finns inte alltid tid att utforma en strategi för X-ray scattering datainsamling på varje prov, således X-ray fluorescens är en värdefull teknik för screening många kristaller och prioritera för vilka prover röntgen scattering data bör samlas in. Dessutom möjliggör X-ray fluorescens datainsamling från prover som inte kan bryta röntgenstrålar. Samtidigt samla X-ray fluorescens data, ibland signalen kan vara mycket svag och de resulterande spektra intetsägande. För att förbättra styrkan på signalen, antingen för X-ray fluorescens eller galna skanning, överväga att öka exponeringstiden och/eller minskar X-ray balk dämpning. När ett prov identifieras för insamling av X-ray scattering data, rekommenderas det att samla X-ray scattering data på en annan del av provet än vad användes för X-ray fluorescens och MAD skanning att minimera strålskador, förbättra kvaliteten på uppgifterna samling, och minimera eventuella minskning av avvikande signal.
Identifiering av radioaktiva spårämnen kräver nanomolar kvantiteter av material eller mindre, och användningen av dessa spårämnen som molekylär spårning agenter ger en enkel och mycket känslig metod för att sondera cellulära processer. Radiometal analysen ovan kan användas för att fastställa totala metall upptag, distribution över cellulära fack, liksom andelen upptag. Faktiskt, varje datapunkt tid kräver en 40 minuters fraktionering; men som varje tidpunkt nås, är celler omedelbart pelleterat och inkuberas i hög salt buffert (figur 5steg 1). Radiometal mätningar av media, kasserade hög salt buffert (figur 5steg 1) och periplasmic och cytoplasmiska fraktioner efter (figur 5steg 3) indikerar hög salt buffert ruvning framgångsrikt tar bort alla återstående oassocierade gratis metall som dröjde kvar efter den inledande centrifugeringen efter att ha nått tidpunkten. Den inledande centrifugeringen tar bort de flesta (upp till 80%) av oassocierade gratis metallen och centrifugeringen efter inkubation i hög salt bufferten tar också bort ytterligare återstående oassocierade gratis metall. Någon kvardröjande oassocierade gratis metall förväntas inte påverka metall transport under den 40 minuter fraktioneringen. Påverkan av 40 minuters fraktionering på intracellulära metall transport är en annan faktor för rationell data tolkning. Praktiskt taget uppstår hela fraktionering protokollet över is, förutom de 30 andra centrifugeringen mellan stegen. Metall transporttiden kurs experiment har visat att upprätthålla celler vid 4 ° C upphäver metall transport20,21,22. Därför, eftersom experimenten sker över is, 40 minuters fraktionering förväntas inte avsevärt öka metall nivåer i periplasm av cytoplasman och metall nivåer förväntas vara representativa tidpunkter där cellerna var initialt centrifugalized.
Bestämning av relativa upptag i olika cellulära fack kan hjälpa informera XFS data, bekräfta fysiologiska beskaffenhet ett substrat samt aktivera utredaren att ytterligare undersöka de molekylära detaljerna för en mekanism. Till exempel tillägg av genetiska mutagenes radiometal upptag experiment ger en direkt metod för att förstärka viktiga funktionella rester eller molekyler inblandade i substrat transport. Fördelarna med radiometal upptag experiment och analyser är snabb vändning, hög genomströmning, hög reproducerbarhet och parallelization experiment jämföra tillväxt villkorar och genetiska konstruktioner.
The authors have nothing to disclose.
Data samlades också in på GM/CA@APS, som har finansierats helt eller delvis med federala medel från National Cancer Institute (ACB-12002) och National Institute of General Medical Sciences (AGM-12006). Denna forskning används resurser av Advanced Photon Source (APS), en US Department of Energy (DOE) Office av vetenskap användaren anläggning drivs för i DOE Office of Science från Argonne National Laboratory under Kontraktsnr DE-AC02-06CH11357. Användningen av Advanced Photon källan stöddes av U. S. Department of Energy, Office of Science, kontor av grundläggande Energivetenskaper, under Kontraktsnr W-31-109-Eng-38.
Vi skulle vilja erkänna den UAB omfattande Cancer Center – Mass Spectrometry/proteomik delade anläggning (P30CA13148-38) för deras hjälp i masspektrometri analys.
C.D.R. stöddes av ett bidrag från University of Alabama Birmingham Office om mångfald, eget kapital och inkludering. L.L.R. stöddes av röntgenavdelningen av University of Alabama i Birmingham. Department of Energy, Office of Science, isotop programmet stöds 52Mn produktion och A.V.F.M. under bevilja DESC0015773.
Chemicals | |||
Polyethylene glycol 4000, EMD Millipore | Fisher | M1097270100 | |
Ampicillin Sodium Salt (Crystalline Powder) | Fisher | BP1760-5 | |
AMRESCO M9 Medium Broth | Fisher | NC9688886 | |
Bis-Tris, Fisher BioReagents | Fisher | BP301-100 | |
Calcium Chloride Dihydrate (Certified ACS) | Fisher | C79-500 | |
Dextrose (D-Glucose) Anhydrous (Granular Powder/Certified ACS) | Fisher | D16-500 | |
Ethylenediaminetetraacetic Acid, Disodium Salt Dihydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S311-100 | |
Fisher BioReagents Microbiology Media: LB Broth, Miller | Fisher | BP1426-500 | |
Magnesium Sulfate Heptahydrate (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | M63-500 | |
Sodium Azide, White Powder | Fisher | BP922I-500 | |
Sodium Chloride (Crystalline/Certified ACS) | Fisher | S271-500 | |
Sodium Phosphate Dibasic Anhydrous (Granular or Powder/Certified ACS) | Fisher | S374-500 | |
Tris Hydrochloride (Small White Flakes/Molecular Biology) | Fisher | BP153-500 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Equipment | |||
Cryschem Plate | Hampton | HR3-158 | |
EMD Millipore Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units | Fisher | UFC903024 | |
EMD Millipore Millex Sterile Syringe Filters: Durapore PVFD Membrane | Fisher | SLHV013SL | |
GE Healthcare HiLoad 26/600 Superdex 200 pg | Fisher | 28-9893-36 | |
GE Healthcare HiTrap IEX HP Prepacked Columns | Fisher | 17-1154-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Cells | |||
Agilent Technologies BL21-CODON PLUS RIPL CELLS | Fisher | 230280 |