Toplanması ve işlenmesi büyük hayvanlar lenf düğümlerinden RNA analizi için: büyük hayvan türlerinin lenf nodu Transcriptomic çalışmalar için hazırlanıyor
Summary
Bu iletişim kuralı kimliği ve lenf düğümlerinden hayvancılık ve yaban hayatının yaklaşımlar örnekleme, eksizyon adımlar dahil olmak üzere büyük hayvanlar dokulardan lenf nodu transcriptomic profilleme için RNA izolasyonu için yordamlar genel bakış sağlar sonrası koleksiyonu saklama ve işleme için RNA analizi için birden fazla hayvan ve dikkat edilmesi gereken noktalar artı temsilcisi sonuçları arasında tutarlılığı sağlamak için.
Abstract
Büyük hayvanlar (hayvancılık ve yaban hayatının) Hayvansal patojenler, brusella, Mycobacterium bovis, Salmonellave E. coli, dahil olmak üzere önemli rezervuar hizmet ve Patogenez çalışma için yararlıdır ve/veya doğal ana bakteri yayılmasını. Lenf düğümleri konak immün yanıt anahtar işlevi ile gen ekspresyonu hücrelerdeki zamansal değişimler enfeksiyon boyunca değerlendirmek için aşağı akım transcriptomic analizleri, RNA’ın potansiyel bir kaynak olarak lenf nodu doku hizmet. Bu makale işlemi lenf nodu koleksiyonu, doku örnekleme ve aşağı akım RNA ve Hayvancılık, işleme sığır (Bos Toros) Amerikan bizonu (bizon bizon sağlanan ek örnekler ile bir model olarak kullanarak genel bir bakış sunar ). Protokol vücutta konumunu, kimlik ve lenf nodlarının birden çok anahtar site kaldırma hakkında bilgi içerir. Ayrıca, bir biyopsi örnekleme yöntem örnekleme bir tutarlılık için birden çok hayvanlar arasında sağlayan sunulur. RNA RNA-sıralama ve RT-PCR gibi aşağı akım yöntemleri için uygun üretimi dahil olmak üzere örnek korunması için birkaç önemli noktalar ele alınmaktadır. Büyük hayvan vs fare saat ders çalışmalarında doğal uzun gecikmeler nedeniyle bozulması bağlamında incelenmesi, bu doku türü zaman tabii açıklamak için bizon ve sığır lenf nodu doku temsilcisi sonuçları sunulmuştur RNA bozulması diğer dokularda önceki metodolojik çalışma. Genel olarak, bu iletişim kuralı transcriptome projeler büyük hayvan örnekleri üzerinde başlayan her iki veteriner araştırmacılar ve moleküler biyologlar vivo içinde doku örnekleme ve vitro işleme teknikleri öğrenmeye ilgi için faydalı olacaktır.
Introduction
Transcriptome lenf nodlarının analizini RNA-sıralama patojenler çeşitli hayvanların bağışıklık yanıtı karakterize etmek için fırsat sunuyor. Bu yöntemi yaygın olarak fareler kullanılmıştır iken, analizleri daha büyük memeliler1,2son zamanlarda genişleyen. Hayvancılık/büyük hayvan lenf düğümleri bir enfeksiyon, sadece aşı veya genetik yatkınlık çalışmaları onların kullanım için ve hedefleri için ilaç geliştirme, aynı zamanda insan çalışmaları için model sistemleri olarak tanımlanması için ana bilgisayar yanıt karakterize için kullanılabilir Hayvansal hastalıklar. Örneğin, brusella (etkileri dünya çapında her yıl yarım milyon kişi bir Hayvansal bakteriyel hastalığı) olması durumunda, artmasına rağmen önemli ölçüde maliyeti, çalışmalarda koyun veya keçi insan enfeksiyonu ve insan aşı daha alakalı vardır gelişme laboratuvar hayvan modellere kıyasla. Retiküloendotelyal sistem enfeksiyonu ama değil karakteristik klinik belirtiler3. fare enfeksiyon modelleri özetlemek
Laboratuvar hayvan çalışmaları ile karşılaştırıldığında büyük hayvan deneyleri içinde işlemi mutlaka hasat doku ötenazi korunması için potansiyel bir meydan okuma sunuyor doku koleksiyonu arasında daha uzun bir gecikme oluşur. yüksek kaliteli RNA. Sağlam RNA biyolojik ilgili transcriptomic veri üretimi için önemlidir. Yüksek kaliteli RNA doku örneklerinden nesil koruma tesislerinde özellikle kritik büyük hayvan patojen araştırmalar yapılır. Bu tür çalışmalar sadece onaylı imkanları ve yüksek eğitimli personel gerektirir ama hangi iş bağlı olarak, on binlerce dolar yüzlerce arasında olabilir önemli finansal maliyetler de taşımak gerçekleştirmek doğal olarak daha zordur. Bu tür çalışmalar da bir disiplinler arası işbirliği ve onların karmaşıklık ekleyerek onların tamamlanması için disiplinler arası bilgi içerir. Bu nedenle, üzerinde eğitim, geliştirilmesi ve bağlılık bir aerodinamik sistemi örnek toplanması ve korunması için önemli yararları sağlar dokulara aşağı akım Moleküler çalışmalar için enfekte hayvan–dan.
Daha büyük lenf düğümleri topluluğu için fare lenf nodlarının örnekleme benzer karşılaştırıldığında doku koleksiyonu için ek sorunlar sunar. Örnek eksizyon için hazırlık ilgili iç yapılarını da içeren lenf nodu anatomisi temel bir anlayış gerektirir. Bir lenf nodu yapısını lenfoid lobules lenf ile dolu sinüsler çevrili oluşmaktadır. Bu yapılar içinde sert, fibröz kapsül içine alınır. 4 bir lenfoid kulak “temel anatomik ve fonksiyonel lenf nodu” birimidir ve köklerinin, derin kortikal bir birim ve medüller kordlar ve sinüsler4 (resim 1A) oluşur. B ve T lenfositler ev köklerinin ve derin kortikal birimleri, sırasıyla. Bu yapıların bir 3D iskele sağlamak ve lenfositler ve antijen veya antijen sunan hücreler arasındaki etkileşimi kolaylaştırmak.
Onlar daha yoğun bir retiküler meshwork içeren ve daha hassas bir retiküler meshwork oluşmaktadır ve hafif görünür sinüsler daha koyu görünmesini fena halde, köklerinin ve derin kortikal birimler kesilmiş yüzeyine belirlenebilir (Şekil 1B). Geleneksel olarak, patologlar lenf düğümleri olarak yüzeysel korteks (folikül), paracortex (derin kortikal adet) ve medulla (medüller kordlar ve sinüsler) bölgelerinde bakın. Uygun bir inceleme, tüm üç bölgeler olarak en iyi uygulama rutin patolojik muayene yönergeler lenf düğümleri5için kabul edilmiştir. Tutarlılık, boyutu ve rengi tek bir hayvan içinde bile lenf nodlarının önemli farklılıklar olduğunu unutmayın. Hayvan yaşlandıkça, onların lenf düğümleri boyutu küçülür ve bu genç hayvanlar daha sıkı hale, genellikle kendi bağ dokusu ve lenfoid normal bir azalma artış nedeniyle6,7yapısı için eğiliminde olacaktır.
Şekil 1. Lenf nodu anatomisi. (A) Bu çizgi film görüntü anahtar yapıları betimleyen lenf nodu anatomisi gösterir. (B) bu hala görüntü kesit içinde kesilmiş sığır bir lenf nodu gösterir. Çıplak gözle görülebilir ilgili yapılar/katmanları vurgulanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Deneysel soru bağlı olarak farklı lenf düğümleri toplama ve analiz için ilgi olacaktır. Periferik lenf düğümleri derin subkutan dokuda bulunan bunlar. Sığır, periferik veya yüzeysel lenf düğümleri genellikle klinik ve deneysel uygulamada kullanılan parotid, çene, retropharyngeal, prescapular, prefemoral dahil (precrural) ve yüzeysel kasık (supramammary içinde dişi, erkeklerde testis) () Şekil 2). Tablo 1‘ de, anahtar yüzeysel lenf düğümleri, özelliklerini sığır sistem8‘ de açıklandığı gibi özetlenmiştir. Aşağıda, bazı potansiyel lenf nodu toplama planları sığır bulaşıcı bakteriyel hastalıklar için soruşturma için bir başlangıç noktası olarak sunulmuştur.
Brusella abortus/brusella melitensis: Standart necropsies B. abortusiçin-enfekte sığır ve B. melitensis-virüslü keçi ulusal hayvan hastalığı Merkezi kurtarmak supramammary, prescapular ve parotid lenf nodu doku , hem ana bilgisayar RNA ifade profil oluşturma için RNA hazırlık ve bakteriyel numaralandırma için dövmek icin. B. abortus düzenli olarak her deneysel olarak enfekte sığır9. bu lenf düğümlerinin elde edilebilir Bu lenf nodu türlerinin her biri bakteri varlığı içinde B. melitensistespit edilebilir-enfekte keçi kadar düşük çalışmalarımız (yayınlanmamış Boggiatto vd.,) RNA tabanlı yöntemlerini kullanarak en az dokuz ay sonrası enfeksiyon. Salmonella SP.: prescapular, subiliac (prefemoral), ve mezenterik lenf düğümleri-si olmak be yararlı sığır karkas Salmonella yaygınlık10,11,12 profilleme sırasında ve transcriptomic çalışmalar için potansiyel ilgi olacak. E. coli O157: H7: mezenterik lenf düğümleri (at orta ince bağırsak ve distal ince bağırsak mekanlar) bakteriler enfekte buzağı (ancak değil enfekte yetişkin sığır)13ara sıra bir kurtarma siteleri olabilir. Leptospirosis (Leptospira sp.): bakterilerin kronik bir sebat meme bezi14drenaj lenf düğümleri gözlenmiştir. Mycobacterium bovis : Sığır, bakteri trakeobronşiyal ve mediastinal lenf düğümleri kurtarılan sonrası deneysel enfeksiyondan buzağı15olmuştur. Ayrıca, lenf nodu RNA virüsleri, domuz üreme ve solunum Sendromu virüs2gibi büyük hayvan ana bilgisayar yanıt incelemek için kullanılmıştır. Şekil 2 bir alt sığır vücuttaki bu büyük lenf düğümlerinin konumunu gösteriyor.
Resim 2: Çizgi film seçilen lenf nodu yerlerde tasvir Bos Toros . Numaralandırılmış lenf düğümleri açıklamalı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Bu kağıt ve ilişkili video, biz büyük hayvan lenf düğümleri moleküler biyologlar büyük hayvan enfeksiyonları transcriptomic çalışmalarda yer için bilgilendirici olacak şekilde RNA etütler yalıtım için bir iletişim kuralı mevcut. İlk olarak, biz genel bir bilgi yalıtım yordamı lenf düğümleri için örnekleme sığır ve bizon dokulara gelen örnek olarak kullanarak sağlar. Bu gösteri ile videoda gösterildiği eşleştirilmiş, RNA izolasyonu için tekrarlanabilir doku örnekleme için iş akışı olduğunu. Ardından, güvenlik, tutarlılık ve RNA kalite odaklı bir virüslü bir lenf düğümünün işlenmesi için önemli hususlar açıklanmaktadır.
RNA hazırlanması ile bir acidified fenol-guanidin isothiocyanate reaktif dokusundan Chomczynski ve Sacchi16,17, silis tabanlı spin sütunlar varlığı üzerinde bir arıtma ile orijinal yöntemine dayalı chaotropic ajanlar Vogelstein ve Gillespie18özgün çalışmasına dayanmaktadır. Biz de sığır lenf bezleri alternatif yöntemler tarafından korunmuş transcriptomics için RNA’ın kurtarma için potansiyel incelemek. Son olarak, biz ötenazi ve örnekleme bizon kurtarılan RNA profilden üzerinde arasında bir artış etkisini gösteren temsili bir deney dahil olmak üzere büyük hayvan Nekropsi RNA kalitesinde zaman değişken etkisini keşfedebilirsiniz ve sığır lenf bezleri. Bu makalede sadece moleküler biyologlar ama da için veteriner araştırmacılar transcriptomic çalışmalar başlıyor işe.
Protocol
Representative Results
Discussion
Transcriptomic çalışmaları ve ilgili protokolleri çoğunluğu fare, sıçan veya öldükten sonra insan örnekleri üzerinde odaklanın. Ancak, Hayvancılık ve yaban hayatının araştırmalarda çok çeşitli insan halk sağlığı için hastalık, hem veteriner ilaçları ve hayvansal hastalıklar açısından uygulanabilir olarak bağışıklık yanıtı karakterizasyonu için fırsatlar sağlar. Bu iletişim kuralı bir taslağını dokuları yüksek bütünlük RNA çıkarılması için kritik noktalar sığı…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazar James Fosse mükemmel çalışmaları tüm videografisi ve video işleme için teşekkür etmek istiyorum; Michael Marti sayısallaştırılmış sığır görüntüleri nesil mükemmel çalışmaları için; Lilia Walther RNA çıkarma konusunda ona yardım için ve Bioanalyzer çalışır; Mitch Palmer ve yararlı bir daha gözden geçirme ve geribildirim lenf nodu görüntülerde Carly Kanipe; ve hayvan bakımı ve veteriner kadroyla ulusal hayvan hastalığı Merkezi için tüm-in onların sert iş ve hayvancılık ile ilgili yardım ve Nekropsi için hazırlık.
Materials
| RNA preservation solution (we used RNALater for all experiments) | ThermoFisher | AM7020 | |
| 1.5 ml or 2 ml polypropylene microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Disposable scalpels | Daigger Scientific | EF7281 | |
| Tissue forceps, rat tooth | Fisher Scientific | 12-460-117 | Other tissue forceps available including curved tip, tapered edge, etc. , depends on user preference |
| 3 mm punch biopsy needles | Fisher Scientific | NC9949469 | |
| Sharps container (small and transportable for necropsy) | Stericycle | 8900SA | 1 qt. size shown here |
| Cutting boards or disposable trays | Fisher Scientific | 09-002-24A | Available in a variety of sizes, depends on user preference |
| Personal protective equipment | Varies with pathogen (gloves, respirator masks, goggles, etc.) | ||
| Phenol-based RNA extraction reagent (we used TRIzol Reagent for all experiments) | ThermoFisher | 15596026 | |
| Silica column-based RNA extraction kit (we used the PureLink RNA Mini kit for all experiments) | ThermoFisher | 12183018A | Designed for up to 100 mg tissue |
| 100% Ethanol (200 proof for molecular biology) | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Tissue homogenizer with enclosed homogenization tubes (we used the gentleMACS dissociator for all experiments) | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Agarose (General, for gel electrophoresis) | Sigma-Aldrich | A9539 | |
| 1X TBE | Fisher Scientific | BP24301 | Can also make from scratch in the laboratory |
| Deionized formamide | EMD Millipore | S4117 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | |
| Bromophenol blue | Sigma-Aldrich | 114391 | |
| Xylene cyanol | Sigma-Aldrich | X4126 | |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid) | Sigma-Aldrich | EDS | |
| UV-Vis Spectrophotometer (we used the NanoDrop Spectrophotometer) | ThermoFisher | ND-2000 | |
| Device for quantitative RNA assessment (we used the Bioanalyzer, with associated components and protocols) | Agilent | G2939BA | |
| FFPE RNA extraction kit (we used the RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit for Formalin Fixed, Paraffin Embedded Tissue) | ThermoFisher | AM1975 | |
| Plastic spreader (L-shaped spreader) | Fisher Scientific | 14-665-231 | Only needed for sterility testing for samples from infected animals |
| Necropsy knives | Livestock Concepts | WI-0009209 |
References
- Tizioto, P. C., et al. Immunological response to single pathogen challenge with agents of the bovine respiratory disease complex: an RNA-sequence analysis of the bronchial lymph node transcriptome. PLoS One. 10 (6), e0131459 (2015).
- Miller, L. C., et al. Analysis of the swine tracheobronchial lymph node transcriptomic response to infection with a Chinese highly pathogenic strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. BMC Veterinary Research. 8, 208 (2012).
- Silva, T. M. A., Costa, E. A., Paixao, T. A., Tsolis, R. M., Santos, R. L. Laboratory animal models for brucellosis research. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 518323 (2011).
- Willard-Mack, C. L. Normal structure, function, and histology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34, 409-424 (2006).
- Elmore, S. A. Histopathology of the lymph nodes. Toxicologic Pathology. 34 (5), 425-454 (2006).
- Luscieti, P., Hubschmid, T. h., Cottier, H., Hess, M. W., Sobin, L. H. Human lymph node morphology as a function of age and site. Journal of Clinical Pathology. 33 (5), 454-461 (1980).
- Hadamitsky, C., et al. Age-dependent histoarchitectural changes in human lymph nodes: an underestimated process with clinical relevance?. Journal of Anatomy. 216 (5), 556-562 (2010).
- Sisson, S., Grossman, J. D., Getty, R. . Sisson and Grossman’s The Anatomy of Domestic Animals, Volume 1. , (1975).
- Olsen, S. C., Johnson, C. Comparison of abortion and infection after experimental challenge of pregnant bison and cattle with Brucella abortus strain 2308. Clinical and Vaccine Immunology. 18 (12), 2075-2078 (2011).
- Brichta-Harhay, D. M., et al. Microbiological analysis of bovine lymph nodes for the detection of Salmonella enterica. Journal of Food Protection. 75 (5), 854-858 (2012).
- Samuel, J. L., O’Boyle, D. A., Mathers, W. J., Frost, A. J. Isolation of Salmonella from mesenteric lymph nodes of healthy cattle at slaughter. Research in Veterinary Science. 28 (2), 238-241 (1980).
- Arthur, T. M., et al. Prevalence and characterization of Salmonella in bovine lymph nodes potentially destined for use in ground beef. Journal of Food Protection. 71 (8), 1685-1688 (2008).
- Cray, W. C., Moon, H. W. Experimental infection of calves and adult cattle with Escherichia coli O157:H7. Applied and Environmental Microbiology. 61 (4), 1586-1590 (1995).
- Thiermann, A. B. Experimental leptospiral infections in pregnant cattle with organisms of the Hebdomadis serogroup. American Journal of Veterinary Research. 43 (5), 780-784 (1982).
- Palmer, M. V., Waters, W. R., Whipple, D. L. Investigation of the transmission of Mycobacterium bovis from deer to cattle through indirect contact. American Journal of Veterinary Research. 65 (11), 1483-1489 (2004).
- Chomczynski, P. A reagent for the single-step simultaneous isolation of RNA, DNA, and proteins from cell and tissue samples. BioTechniques. 15 (3), 532-537 (1993).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Vogelstein, B., Gillespie, D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 76 (2), 615-619 (1979).
- . . AVMA Guidelines for the Euthanasia of Animals. , (2013).
- . . TRIzol Reagent Manual. , (2016).
- . . Disruption and Homogenization of Tissue for the Extraction of RNA. , (2014).
- . . PureLink RNA Mini Kit Protocol . , (2012).
- . . RNA Gel-loading Buffer. , (2006).
- Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. Nondenaturing Agarose Gel Electrophoresis of RNA. Cold Spring Harbor Protocols. , (2010).
- Mueller, O., et al. A microfluidic system for high-speed reproducible DNA sizing and quantitation. Electrophoresis. 21 (1), 128-134 (2000).
- Schroeder, A., et al. The RIN: an RNA integrity number for assigning integrity values to RNA measurements. BMC Molecular Biology. 7 (3), (2006).
- Suvarna, K. S., Layton, C., Bancroft, J. D. . Bancroft’s Theory and Practice of Histological Techniques. , (2012).
- Medawar, P. B. The rate of penetration of fixatives. Journal of Microscopy. 61 (1-2), 46-57 (1941).
- Canene-Adams, K. Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry. Methods in Enzymology. 533, 225-233 (2013).
- Fleige, S., Pfaffl, M. W. RNA integrity and the effect on the real-time qRT-PCR performance. Molecular Aspects of Medicine. 27, 126-139 (2006).
- Fajardy, I., et al. Time course analysis of RNA stability in human placenta. BMC Molecular Biology. 10 (21), (2009).
- Bahar, B., et al. Long-term stability of RNA in post-mortem bovine skeletal muscle, liver and subcutaneous adipose tissues. BMC Molecular Biology. 8, 108 (2007).
- Yamagishi, A., et al. Gene profiling and bioinformatics analyses reveal time course differential gene expression in surgically resected colorectal tissues. Oncology Reports. 31 (4), 1532-1538 (2014).
- Choi, S., Ray, H. E., Lai, S. H., Alwood, J. S., Globus, R. K. Preservation of multiple mammalian tissues to maximize science return from ground based and spaceflight experiments. PLoS One. 11 (12), e0167391 (2016).
- Almeida, A., Thiery, J. P., Magdelenat, H., Radvanyi, F. Gene expression analysis by real-time reverse transcription polymerase chain reaction: influence of tissue handling. Analytical Biochemistry. 328 (2), 101-108 (2004).
- Lee, S. M. L., Schelcher, C., Thasler, R., Schiergens, T. S., Thasler, W. E. Pre-analytical determination of the effect of extended warm or cold ischaemia on RNA stability in the human ileum mucosa. PLoS One. 10 (9), e0138214 (2015).
- Kap, M., et al. The influence of tissue procurement procedures on RNA integrity, gene expression, and morphology in porcine and human liver tissue. Biopreservation and Biobanking. 13 (3), 200-206 (2015).
- Hong, S. H., et al. Effects of delay in the snap freezing of colorectal cancer tissues on the quality of DNA and RNA. Journal of the Korean Society of Coloproctology. 26 (5), 316-325 (2010).
- Lee, S. M., et al. RNA stability in human liver: comparison of different processing times, temperatures and methods. Molecular Biotechnology. 53 (1), 1-8 (2013).
- Morrison, P. K., et al. Post-mortem stability of RNA in skeletal muscle and adipose tissue and the tissue-specific expression of myostatin, perilipin and associated factors in the horse. PLoS One. 9 (6), e100810 (2014).
- Seear, P. J., Sweeney, G. E. Stability of RNA isolated from post-mortem tissues of Atlantic salmon (Salmo salar L.). Fish Physiology and Biochemistry. 34 (1), 19-24 (2008).
- Marchuk, L., Sciore, P., Reno, C., Frank, C. B., Hart, D. A. Postmortem stability of total RNA isolated from rabbit ligament, tendon, and cartilage. Biochimica et Biophysica Acta. 1379 (2), 171-177 (1998).
- Inoue, H., Kimura, A., Tuji, T. Degradation profile of mRNA in a dead rat body: basic semi-quantification study. Forensic Science International. 130 (2-3), 127-132 (2002).
- Micke, P., et al. Biobanking of fresh frozen tissue: RNA is stable in nonfixed surgical specimens. Laboratory Investigation. 86 (2), 202-211 (2006).
- Srinivasan, M., Sedmak, D., Jewell, S. Effect of fixatives and tissue processing on the content and integrity of nucleic acids. The American Journal of Pathology. 161 (6), 1961-1971 (2002).
- Ahmed, A. M., et al. Variation in the ovine abomasal lymph node transcriptome between breeds known to differ in resistance to the gastrointestinal nematode. PLoS One. 10 (5), e0124823 (2015).
- Russell, G. C., et al. Host gene expression changes in cattle infected with Alcelaphine herpesvirus 1. Virus Research. 169 (1), 246-254 (2012).
- Avraham, R., et al. A highly multiplexed and sensitive RNA-seq protocol for simultaneous analysis of host and pathogen transcriptomes. Nature Protocols. 11, 1477-1491 (2016).
