Um modelo de Mouse Syngeneic câncer pancreático para estudar os efeitos da eletroporação irreversível
Summary
Eletroporação irreversível (IRE) é uma técnica de ablação não térmicos utilizada para o tratamento do câncer de pâncreas localmente avançado. Sendo uma técnica relativamente nova, os efeitos da ira sobre o crescimento do tumor são mal compreendidos. Nós desenvolvemos um modelo de mouse syngeneic que facilita a estudar os efeitos da ira sobre câncer pancreático.
Abstract
Câncer pancreático (PC), uma doença que mata cerca de 40.000 pacientes a cada ano nos Estados Unidos, tem iludidas com sucesso várias abordagens terapêuticas, incluindo as estratégias de imunoterapia promissoras. Eletroporação irreversível (IRE) é uma técnica de ablação não térmicos que induz a morte de células de tumor sem destruição de estruturas colágenas adjacentes, permitindo, assim, o procedimento a ser realizado nos tumores muito perto dos vasos sanguíneos. Ao contrário de técnicas de ablação térmica, IRE resulta na morte de células apoptóticas gradual, juntamente com necrose imediata ablação induzida e está atualmente em uso clínico para pacientes selecionados com PC localmente avançado. Um ablativo, procedimento específico não-alvo como IRE pode induzir uma infinidade de respostas no microambiente do tumor. Poucos estudos abordaram-se os efeitos da ira sobre o crescimento do tumor em outros tipos de tumor, mas nenhum têm-se centrado no PC. Desenvolvemos um modelo de syngeneic do mouse do PC no qual subcutâneo (SQ) e ortotópico tumores podem ser tratadas com sucesso com ira em um ambiente altamente controlado, facilitando o processo de post vários estudos longitudinais. Este modelo animal serve como um sistema robusto para estudar os efeitos da ira e maneiras de melhorar a eficácia clínica da ira.
Introduction
Adenocarcinoma ductal pancreático (PC) é projetada para se tornar a segunda causa principal de mortes por câncer nos Estados Unidos em torno de 20201. A grande maioria dos pacientes diagnosticados com PC acabará por morrer de doença metastática distante2. O microambiente de PC é notoriamente imunossupressor e chemoresistant. Seu estroma desmoplásico contém uma escassez das células T efetoras (anti-tumorais) e uma proeminência de leucócitos imunossupressoras, incluindo macrófagos tumor-associado (TAMs), mieloide supressor derivada de células (MDSCs) e pilhas de T reguladora (Tregs)3 . Estas fundamentam a necessidade de desenvolver estratégias multimodais que neutralizar estes efeitos do microambiente.
IRA foi desenvolvida como um método não-térmica de ablação de tumor. Ao contrário de técnicas de ablação térmica, IRE não causa necrose coagulativa rápida, mas em vez disso resulta em gradual apoptose celular morte4. Importante para tumores pancreáticos, a ira não é vulnerável aos efeitos de “dissipador de calor” e pode ser realizada ao lado de vasos sanguíneos5. Esta tecnologia tem 510 autorização do FDA6 e atualmente está sendo usada clinicamente, para pacientes selecionados com localmente avançado ou no limite ressecável câncer pancreático. A maior série publicados de IRE para PC7, a sobrevida mediana dos pacientes submetidos à ira foi aproximadamente dobro a sobrevivência dos pacientes tratados com quimioterapia moderna sozinha sem ressecção8,9.
Vários estudos têm demonstrado que a ablação térmica induz uma resposta imune sistêmica em outros tipos de tumor (revisto em Chu et al 10). ablação por radiofrequência (RFA) em tumor animal modelos conduzem ao aumento de células T, se infiltra11,12, incluindo um aumento nas células ativadas assassinas naturais (NK) em hepatocelular câncer pacientes13, 14e uma diminuição de Tregs imunossupressoras em de pacientes de câncer de pulmão15. Um número muito menor de estudos examinaram imunológico, microenvironmental e respostas de lesão para IRE16. IRA foi mostrada para estimular uma resposta imune sistêmica em modelos do rato imunocompetentes em que o crescimento dos enxertos de células renais (contralateral) secundário foi reduzido ou impedido pela ira de um tumor primário duas semanas anteriores17. Eles também observaram que camundongos imunocompetentes necessários menos tensão para regressão completa do que ratos imunodeprimidos. Isso tem sido a hipótese que ira pode resultar na apresentação de antigénios melhorado em comparação com a necrose coagulativa da ablação térmica, mas isto não tem sido estudado especificamente.
Desenvolvemos um modelo de syngeneic do mouse do PC da linha de celular de KPC-Luc 4580 (presente do J.J. Yeh na Universidade da Carolina do Norte), que foi derivado de um tumor que se desenvolveu em um macho LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse, para estudar os efeitos locais e sistêmicos de IRE18,19. Esta linha de celular do luciferase-expressando é imunogênica e também tumorigênico em imunocompetentes camundongos C57BL/6, quando injetado SQ ou orthotopically e confiantemente produz metástases hepáticas quando injetado o baço. Podemos ter utilizado um gerador de pulso de onda quadrada programável para entregar 100 µs pulsos de eletricidade em uma relação de tensão/distância de 1.500 V/cm, usando uma sonda de matriz de dois-agulha (separados por 5 mm) ou platina pinça-eletrodos para tumores SQ ou ortotópico, respectivamente, em ratos para modelar os efeitos da ira em um animal pequeno.
Protocol
Representative Results
Discussion
Neste estudo, demonstramos um modelo de rato imunocompetentes para PC que pode ser usado para estudar os efeitos da ira sobre o crescimento do tumor. Atualmente, o Ira está sendo usada como uma técnica de ablação térmica não apenas em pacientes altamente selecionados de PC localmente avançados que não têm progressão da doença distante depois de meses de terapia pré-operatória. Seu uso, portanto, tem sido limitado, porque a maioria dos pacientes com PC localmente avançado desenvolver doença metastática dis…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RAW tem recebido apoio para este trabalho de uma bolsa de Investigação translacional colaborativo financiado pelo C3 San Diego Padres Pedal a causa (#PTC2017).
Materials
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
References
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