Un modello murino di cancro del pancreas Syngeneic per studiare gli effetti dell'elettroporazione irreversibile
Summary
Elettroporazione irreversibile (IRE) è una tecnica di ablazione non-termica utilizzata per il trattamento del cancro del pancreas localmente avanzato. Essendo una tecnica relativamente nuova, gli effetti di IRE sulla crescita del tumore sono capiti male. Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo che facilita lo studio degli effetti dell’IRE su cancro del pancreas.
Abstract
Cancro del pancreas (PC), una malattia che uccide circa 40.000 pazienti ogni anno negli Stati Uniti, ha eluso con successo diversi approcci terapeutici che le strategie immunoterapeutiche promettente. Elettroporazione irreversibile (IRE) è una tecnica di ablazione non termica che induce la morte delle cellule tumorali senza distruzione delle strutture adiacenti collagene, consentendo in tal modo la procedura deve essere eseguita nei tumori molto vicino ai vasi sanguigni. A differenza delle tecniche di ablazione termica, IRE risultati nella morte cellulare apoptotica graduale, insieme a necrosi immediata ablazione indotto ed è attualmente in uso clinico per i pazienti selezionati con PC localmente avanzato. Un ablativo, non bersaglio procedura specifica come IRE può indurre una miriade di risposte nel microambiente tumorale. Pochi studi hanno affrontato gli effetti di IRE sulla crescita del tumore in altri tipi di tumore, ma nessuno si sono concentrati sul PC. Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo del PC in cui sottocutaneo (SQ) e orthotopic tumori possono essere trattati con successo con IRE in un ambiente altamente controllato, facilitando le varie routine di post di studi longitudinali. Questo modello animale serve come un sistema robusto per studiare gli effetti dell’IRE e modi per migliorare l’efficacia clinica di IRE.
Introduction
L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PC) è proiettato a diventare la seconda causa principale delle morti del cancro negli Stati Uniti intorno 20201. La stragrande maggioranza dei pazienti diagnosticati con il PC alla fine muoiono dalla malattia metastatica a distanza2. Il microambiente di PC è notoriamente immunosopressivo e chemioresistente. Relativo stroma desmoplastico contiene una scarsità di cellule T effettrici (anti-tumorale) e una prominenza dei leucociti immunosoppressori, tra cui i macrofagi associati al tumore (TAM), cellule mieloidi soppressore derivate (MDSC) e cellule T regolatorie (Treg)3 . Questi sono alla base della necessità di sviluppare strategie multimodali che neutralizzano questi effetti del microambiente.
IRE è stata sviluppata come un metodo non-termica di ablazione del tumore. A differenza delle tecniche di ablazione termica, IRE non causa necrosi coagulativa rapida ma invece si traduce in graduale apoptotica delle cellule morte4. D’importanza per i tumori pancreatici, IRE non è vulnerabile agli effetti di “dissipatore di calore” e può essere eseguita proprio accanto a vasi sanguigni5. Questa tecnologia ha spazio di 510 (k) dalla FDA6 ed è attualmente utilizzata clinicamente, per i pazienti selezionati con cancro pancreatico resecabile localmente avanzato o borderline. La più grande serie pubblicati di IRE per PC7, la sopravvivenza mediana dei pazienti sottoposti a IRE era approssimativamente doppia la sopravvivenza dei pazienti trattati con chemioterapia moderna da solo senza resezione8,9.
Parecchi studi hanno dimostrato che l’ablazione termica induce una risposta immunitaria sistemica in altri tipi di tumore (rivisto in Chu et al. 10). l’ablazione di radiofrequenza (RFA) in modelli animali del tumore comporta aumentata delle cellule di T si infiltra11,12, compreso un aumento in cellule attivato natural killer (NK) epatocellulare cancro pazienti13, 14e una diminuzione in immunosopressiva Treg nel polmone cancro pazienti15. Un numero molto inferiore di studi hanno esaminato immunitario, microambiente e danno risposte a IRE16. IRE ha dimostrata di stimolare una risposta immunitaria sistemica in modelli di topi immunocompetenti in cui la crescita di osso omoplastico secondario (controlaterale) renale delle cellule è stato ridotto o evitata con IRE di un tumore primario due settimane precedenti17. Essi hanno anche osservato che i topi immunocompetenti richiesto meno tensione per regressione completa che ha fatto topi immunocompromessi. È stato ipotizzato che potrebbe causare IRE presentazione antigenica migliorata rispetto alla necrosi coagulativa di ablazione termica, ma questo non è stato specificamente studiato.
Abbiamo sviluppato un modello syngeneic del topo del PC dalla linea cellulare KPC-Luc 4580 (regalo da J.J. Yeh presso University of North Carolina), che è stato derivato da un tumore sviluppatosi in un maschio LSL-KrasG12D / +; LSL-Trp53R172H / +; PDX1Cre / +; LSL-ROSA26 Luc / + mouse, per studiare gli effetti locali e sistemici di IRE18,19. Questa linea cellulare che esprime luciferasi è immunogenico e anche cancerogeni in topi C57BL/6 immunocompetenti quando iniettato SQ o orthotopically e produce in modo affidabile le metastasi del fegato quando iniettato nella milza. Abbiamo utilizzato un generatore di impulsi programmabile onda quadra per consegnare 100 µs impulsi di energia elettrica ad un rapporto di tensione/distanza di 1.500 V/cm utilizzando una sonda di allineamento di due aghi (separati da 5 mm) o platino pinzette-elettrodi ai tumori SQ o ortotopico, rispettivamente, in topi di modellare gli effetti di IRE in un piccolo animale.
Protocol
Representative Results
Discussion
In questo studio, abbiamo dimostrato un modello di topo immunocompetenti per PC che può essere utilizzato per studiare gli effetti dell’IRE sulla crescita del tumore. Attualmente, IRE è utilizzata come una tecnica di ablazione non termico solo in altamente selezionati pazienti localmente avanzati del PC che non dispongono di progressione di malattia a distanza dopo mesi di terapia preoperatoria. Suo uso è stato limitato quindi perché la maggior parte dei pazienti con localmente avanzato PC sviluppare malattia metasta…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
RRW ha ricevuto sostegno per questo lavoro da un assegno di ricerca traslazionale collaborativo finanziato dal C3 San Diego Padres pedale la causa (#PTC2017).
Materials
| ECM 830 square wave electroporator | Harvard Apparatus | BTX # 45-0002 ( 58018-004 ) | |
| 2 needle array electrode | Harvard Apparatus | 45-0167 | |
| Safety foot switch | Harvard Apparatus | 45-0211 | |
| Platinum Tweezer-trode | Harvard Apparatus | 45-0486 | |
| DMEM-F12 media | ThermoFisher Scientific | 11320-033 | |
| Fetal Bovine Serum | ThermoFisher Scientific | 10437028 | |
| Trypsin | ThermoFisher Scientific | 25200056 | |
| Matrigel | Corning | 354230 | |
| Isoflurane | Sigma-Aldrich, Inc. | 792632 | |
| Lacrilube | Fisher Scientific | 19090646 | |
| Buprenorphine | Fisher Scientific | NC1292810 | |
| D-luciferrin | Perkin Elmer | 122799 | |
| IVIS Spectrum In Vivo Imaging System | Perkin Elmer | 124262 | |
| Mouse strain C57BL/6J | The Jackson Laboratory | 000664/Black 6 | |
| Cell line (KPC-Luc 4580) | J.J. Yeh Lab at University of North Carolina | ||
| BD Precisionglide syringe needles | Sigma-Aldrich, Inc. | Z192406 | |
| Alcohol Swab(70% isopropyl alcohol ) | BD | 326895 | |
| Digital calipers | ThermoFisher Scientific | 14-648-17 | |
| Disposable Scalpels, Sterile | VWR | 21909 | |
| Cotton Tipped Applicators | VWR | 89198 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 6-0 | Harvard Apparatus | 72-3308 | |
| Suture Needle, 45 cm, Size 4-0 | Harvard Apparatus | 72-3314 | |
| Povidone-iodine 10% | BD | 29900-404 | |
| Disposable Warming Pad | KENT SCIENTIFIC CORP. | TP-3E | |
| Mouse Hair Clipper | KENT SCIENTIFIC CORP. | CL8787 | |
| Surgical Drape | Harvard Apparatus | 59-7421 | |
| Phosphate-buffered Saline | ThermoFisher Scientific | 10010023 | |
References
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