ניתוח stereotaxic מניפולציה גנטית בתאים Striatal של מוח העכבר Neonatal
Summary
אנו מתארים פרוטוקול של ניתוח stereotaxic עם מכשיר ביתי הראש-קבוע עבור ריאגנטים microinjecting לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. טכניקה זו מאפשרת מניפולציה גנטית ב תאים עצביים של אזורים ספציפיים של מוח העכבר neonatal.
Abstract
גנים רבים באים לידי ביטוי מוח עובריים, חלק מהם מתבטאים באופן רציף במוח לאחר הלידה. עבור גנים ביטוי בהתמדה כאלה, הם עשויים לפעול כדי לווסת את תהליך התפתחותי ו/או תפקיד פיזיולוגי במוח neonatal. לחקור פונקציות הנוירוביולוגי של גנים ספציפיים במוח, זה חיוני כדי להשבית את הגנים במוח. כאן, אנו מתארים שיטה stereotaxic פשוטה כדי להשבית ביטוי גנים ב סטריאטום של העכברים הטרנסגניים ב windows בפעם neonatal. וירוסים AAV-eGFP-Cre היו microinjected לתוך סטריאטום Ai14 כתב ג’ין עכברים ביום כמחנכת (P) 2 באמצעות ניתוח מוח stereotaxic. בביטוי הגן כתב tdTomato זוהה סטריאטום P14, רומז ש-cre-loxP מוצלח מתווכת רקומבינציה DNA בתאים AAV transduced striatal. אנחנו עוד יותר תוקף טכניקה זו על-ידי microinjecting וירוסים AAV-eGFP-Cre לתוך P2Foxp2חליל/חליל עכברים. תיוג הכפול של ה-GFP, Foxp2 הראה כי תאים GFP-חיוביות חסרה Foxp2 immunoreactivity ב סטריאטום P9, רומז על אובדן Foxp2 החלבון בתאים striatal AAV-eGFP-Cre transduced. יחדיו, תוצאות אלו מדגימות של מחיקה גנטי אפקטיבי על ידי וירוסים stereotaxically microinjected AAV-eGFP-Cre באוכלוסיות עצביים מסוימים במוחם neonatal של העכברים הטרנסגניים floxed. לסיכום, הטכניקה stereotaxic שלנו מספק פלטפורמה פשוטה וקלה עבור הנדסה גנטית במוח העכבר neonatal. הטכניקה לא ניתן להשתמש רק כדי למחוק גנים באזורים ספציפיים של המוח neonatal, אבל זה גם יכול לשמש כדי להזריק סמים תרופתי, המשדרים עצביים, optogenetics מהונדסים, chemogenetics חלבונים, אינדיקטורים פעילות. עצבית ו ריאגנטים אחרים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal.
Introduction
מחקרים מודרניים של המבנה והתפקוד של המוח בדרך כלל דורשים מניפולציה גנטית של גנים ספציפיים בתוך תאים עצביים. כדי לחקור את הפונקציות של גנים שונים, העכברים הטרנסגניים נושאת אללים mutant, כולל נוק אאוט, טוק-in אללים באופן שגרתי נוצרו. ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים היא שיטה סטנדרטית מקומית לספק סמים, וירוסים, המשדרים, אחרים אזורים ספציפיים של המוח מכרסמים1,2. החלת ניתוח מוח stereotaxic את העכברים הטרנסגניים מתיר אחד גנטית לתפעל את תפקוד הגן ואת פעילות. עצבית באוכלוסיות ספציפיות עצביים במוח העכבר. המניפולציה ייחודיים לסוג התא מספקת גישה רב-עוצמה לפענח עצביים פונקציות מורכבות את המעגלים העצביים של המוח3,4,5.
התפתחות עצבית של מערכת העצבים מתחילה אצל בשלבים עובריים מוקדמים ולהמשיך התהליכים התפתחותית לאחר הלידה עד תקופת ילדותי. כמחנכת ההבשלה של מערכת העצבים כולל את החיווט סינפטית מדויק של המעגלים העצביים, שהוא חיוני עבור פונקציות פיזיולוגיים, קוגניטיביים של המוח6. לכן, לימוד התפתחותית אירועים שמתרחשים בחלונות זמן neonatal חשוב לא רק להבנת התפתחות עצבית רגילה, אך זה עשויים גם כן לספק תובנות בפתוגנזה של התפתחותיות והפרעות מנוטלי7 ,8. למרות שיטות ניתוח מוח stereotaxic למכרסמים למבוגרים הם זמינים2,9, כמה פרוטוקולים זמינים באינטרנט עבור ניתוח מוח stereotaxic עכברים neonatal10,11. למעשה, microinjections stereotaxic של ריאגנטים לתוך מוחותיהם של העכבר neonatal הגורים קשים, כי ראשו של הגור neonatal חלש מכדי להיות קבוע במנגנון stereotaxic רגיל. עם זאת, היישום של ניתוח מוח stereotaxic העכברים הטרנסגניים הוא ריאלי עבור עכברים neonatal12. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה עם מלכודת תוצרת בית כדי לבצע ניתוח מוח stereotaxic ב העכבר היילוד הגורים. נדגים כי טכניקה זו מאפשרת למחיקת מותנית גנים floxed על ידי microinjecting recombinase לבטא AAV Cre DNA לתוך סטריאטום של הכתב ג’ין עכברים, מותנה העכברים הטרנסגניים floxed. טכניקה זו ישימה גם כדי לספק ריאגנטים לתוך סטריאטום neonatal של פראי-סוג עכברים.
Protocol
Representative Results
Discussion
במחקר הנוכחי, נדגים שיטה פשוטה ואמינה stereotaxic עבור הזרקת AAV וירוסים לתוך סטריאטום של מוח העכבר neonatal. אנחנו microinjected AAV-eGFP-Cre וירוסים לתוך סטריאטום של עכברים כתב Ai14-P2 ולאחר מכן נותחו בביטוי הגן כתב ב P14. מצאנו ש-AAV transduced תאים GFP-חיובית לאורך כל סטריאטום ברמות rostrocaudal. יתר על כן, כמעט כל התאים GFP-חיובי?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי משרד המדע ולהעניק טכנולוגיה מעניקה MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, מכוני מחקר הבריאות הלאומי NHRI-EX106-10429NI, התוכנית מרכז מחקר אזורים נבחרים מענק משרד החינוך באמצעות מרכז מחקר המוח, האוניברסיטה הלאומית יאנג מינג בטייוואן, ומענקים בתר MOST106-2811-B-010-031 (ס-ווי. סי), MOST105-2811-B-010-036, MOST106-2811-B-010-030 (ה-Y.K.).
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
References
- Athos, J., Storm, D. R. High precision stereotaxic surgery in mice. Current Protocols in Neuroscience. , A.4A.1-A.4A.9 (2001).
- Cetin, A., Komai, S., Eliava, M., Seeburg, P. H., Osten, P. Stereotaxic gene delivery in the rodent brain. Nat. Protoc. 1 (6), 3166-3173 (2006).
- Tye, K. M., Deisseroth, K. Optogenetic investigation of neural circuits underlying brain disease in animal models. Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 251-266 (2012).
- Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
- Knopfel, T. Genetically encoded optical indicators for the analysis of neuronal circuits. Nat. Rev. Neurosci. 13 (10), 687-700 (2012).
- Tau, G. Z., Peterson, B. S. Normal development of brain circuits. Neuropsychopharmacol. 35 (1), 147-168 (2010).
- Mitchell, K. J. The genetics of neurodevelopmental disease. Curr. Opin. Neurobiol. 21 (1), 197-203 (2011).
- Sahin, M., Sur, M. Genes, circuits, and precision therapies for autism and related neurodevelopmental disorders. Science. 350 (6263), (2015).
- Schierberl, K. C., Rajadhyaksha, A. M. Stereotaxic microinjection of viral vectors expressing Cre recombinase to study the role of target genes in cocaine conditioned place preference. J. Vis. Exp. (77), e50600 (2013).
- Mathon, B., et al. Increasing the effectiveness of intracerebral injections in adult and neonatal mice: a neurosurgical point of view. Neurosci. Bull. 31 (6), 685-696 (2015).
- Davidson, S., Truong, H., Nakagawa, Y., Giesler, G. J. A microinjection technique for targeting regions of embryonic and neonatal mouse brain in vivo. Brain Res. 1307, 43-52 (2010).
- Chen, Y. C., et al. Foxp2 controls synaptic wiring of corticostriatal circuits and vocal communication by opposing Mef2c. Nat. Neurosci. 19 (11), 1513-1522 (2016).
- Gerfen, C. R. The neostriatal mosaic: multiple levels of compartmental organization in the basal ganglia. Annu. Rev. Neurosci. 15, 285-320 (1992).
- Karra, D., Dahm, R. Transfection techniques for neuronal cells. J. Neurosci. 30 (18), 6171-6177 (2010).
- Cheetham, C. E., Grier, B. D., Belluscio, L. Bulk regional viral injection in neonatal mice enables structural and functional interrogation of defined neuronal populations throughout targeted brain areas. Front. Neural Circuit. 9, 72 (2015).
