Cirurgia estereotáxica para manipulação genética em células estriadas de cérebro de rato Neonatal
Summary
Descreveremos um protocolo de cirurgia estereotáxica com um dispositivo caseiro de cabeça-corrigido para reagentes microinjecting para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Esta técnica permite a manipulação genética em células neuronais de regiões específicas do cérebro de rato neonatal.
Abstract
Muitos genes são expressos no cérebro embrionário, e alguns deles são continuamente expressas no cérebro após o nascimento. Para tais genes persistentemente expressos, eles podem funcionar para regular o processo de desenvolvimento e/ou função fisiológica no cérebro neonatal. Para investigar as funções neurobiológicas de genes específicos no cérebro, é essencial para inativar genes no cérebro. Aqui, descrevemos um método simples estereotáxica para inactivar a expressão gênica no corpo estriado de ratos transgênicos em janelas de tempo neonatal. O vírus AAV-eGFP-Cre foram injetado para o corpo estriado de ratos de gene repórter Ai14 em dia pós-natal (P) 2 por cirurgia cerebral estereotáxica. A expressão do gene repórter tdTomato foi detectada no corpo estriado de P14, sugerindo um sucesso Cre-loxP mediada por recombinação de DNA em células transfectadas-AAV striatal. Nós validado ainda mais esta técnica por microinjecting o vírus AAV-eGFP-Cre em camundongos P2Foxp2fl/fl . Dupla rotulagem de GFP e Foxp2 mostrou que as células GFP-positivo faltavam Foxp2 imunorreatividade no corpo estriado P9, sugerindo que a perda de proteína Foxp2 em AAV-eGFP-Cre transfectada striatal células. Tomados em conjunto, estes resultados demonstram uma exclusão genética eficaz por stereotaxically microinjected vírus AAV-eGFP-Cre em específicas populações neuronais no cérebro neonatal de floxed ratos transgénicos. Em conclusão, nossa técnica estereotáxica fornece uma plataforma simples e fácil para manipulação genética em cérebro de rato neonatal. A técnica não pode somente ser usada para excluir genes em regiões específicas do cérebro neonatal, mas também pode ser usada para injetar drogas farmacológicas, marcadores neuronais, optogenetics geneticamente modificados e chemogenetics proteínas, indicadores de atividade neuronal e outros reagentes para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal.
Introduction
Estudos modernos da estrutura e função do cérebro normalmente requerem manipulação genética de genes específicos nas células neuronais. Para sondar as funções dos genes diferentes, ratos transgénicos carregando alelos mutantes, incluindo foram rotineiramente gerados nocaute e bater-em alelos. Cirurgia cerebral estereotáxica para roedores adultos é um método padrão para localmente entregar drogas, vírus, marcadores e outros reagentes para regiões específicas do cérebro de roedor1,2. Aplicando a cirurgia estereotáxica cerebral de ratos transgénicos permite um de manipular geneticamente a função dos genes e a atividade neuronal em específicas populações neuronais do cérebro do rato. A manipulação do tipo específico de célula fornece uma poderosa abordagem para decifrar funções neuronais em complexos circuitos neurais do cérebro3,,4,5.
Desenvolvimento neural do sistema nervoso começa em estágios embrionários iniciais, e os processos de desenvolvimento continuam após o nascimento, até o período juvenil. Maturação pós-natal do sistema nervoso inclui a fiação sináptica precisa de circuitos neurais, que é essencial para funções fisiológicas e cognitivas do cérebro6. Portanto, estudar o desenvolvimento eventos que ocorrem em janelas de tempo neonatal é importante não só para compreender o desenvolvimento neural normal, mas também pode fornecer insights sobre a patogênese do desenvolvimento neurológico e transtornos neuropsiquiátricos7 ,8. Embora os métodos de cirurgia cerebral estereotáxica para roedores adultos estão prontamente disponíveis2,9, alguns protocolos estão disponíveis na internet para uma cirurgia estereotáxica cerebral em ratos neonatal10,11. Na verdade, estereotáxicos microinjeções de reagentes no cérebro de filhotes de rato neonatal são difíceis, porque a cabeça do filhote neonatal é demasiado frágil para ser fixada no aparelho estereotáxica padrão. No entanto, a aplicação da cirurgia estereotáxica cerebral de ratos transgênicos é viável para ratos neonatal12. Aqui, descrevemos um método simples com uma armadilha caseira para realizar cirurgia cerebral estereotáxica em filhotes de rato recém-nascido. Vamos demonstrar que essa técnica permite excluir condicionalmente genes de floxed por microinjecting recombinase AAV-expressando Cre DNA para o corpo estriado de ratos de gene repórter e condicionalmente floxed ratos transgénicos. Esta técnica também é aplicável para entregar os reagentes para o neonatal corpo estriado de ratos tipo selvagem.
Protocol
Representative Results
Discussion
No presente estudo, vamos demonstrar um método simples e confiável de estereotáxica para injetar o vírus AAV para o corpo estriado do cérebro do rato neonatal. Nós injetadas vírus AAV-eGFP-Cre para o corpo estriado de ratos de repórter Ai14 em P2 e então analisados a expressão do gene repórter no P14. Nós encontramos que AAV transfectadas células GFP-positivo em todo o corpo estriado em níveis rostrocaudal. Além disso, quase todas as células GFP-positivo co expressaram o gene do repórter de tdTomato nas …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência e tecnologia concede MOST104-2311-B-010-010-MY3, MOST106-2321-B-010-012, os institutos de pesquisa de saúde nacional conceder INDH-EX106-10429NI e programa de centro de pesquisa de áreas Indicados: concessão de o Ministério da educação, através do centro de pesquisa do cérebro, National Yang-Ming University, em Taiwan, e pós-doutorado concede MOST106-2811-B-010-031 (S.-Yc), MOST105-2811-B-010-036 e MOST106-2811-B-010-030 (YK-H.).
Materials
| 30G PrecisionGlide Needle | Becton Dickinson | REF 305106 | |
| Chloroform | JT Baker | 9180-03 | |
| Hamilton MICROLITER Syringe | Hamilton | 80300 | 30G needle fit for PE10 tube; 26G needle needs a PE20 adaptor |
| Polyethylene tubing PE20 | Becton Dickinson | 427406 | |
| Polyethylene tubing PE10 | Becton Dickinson | 427401 | |
| Micro Flow Rate Syringe Pump | Longer Precision Pump Co. | TJ-2A (Controller) and L0107-2A (Drive Unit) | |
| 25G syringe | Becton Dickinson | REF 302105 | |
| Fast green | Sigma-Aldrich | F-7252 | 0.1% |
| Standard Stereotaxic Instruments | RWD Life Science | 68037 | Without using 68030 Mouse/Neonatal Rat Adaptor |
| Anti-FOXP2 antibody | Abcam | ab16046 | Rabbit polyclonal to FOXP2, 1:4K |
| Anti-RFP antibody | Abcam | ab65856 | Mouse monoclonal to RFP, 1:1K |
| BX63 microscope | Olympus | BX63 | |
| LSM 880 confocal microscope | Zeiss | LSM 880 | |
| Goat anti-rabbit conjugated Alexa fluor594 | Jackson lmmunoReserch Laboratories Inc. | 111-585-003 | |
| AAV9.hSynapsin.HI.eGFP-Cre.WPRE.SV40 | Penn Vector Core | AV-9-PV1848 | Lot # CS0987, 5.506×1013 (GC/mL) |
| AAV9.chicken actin-eGFP | AAV core, Institute of Biomedical Sciences, Academia Sinica, Taiwan | N/A | 1×1014 (GC/ml) |
| B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J | The Jackson Labtorary | 007914 | Ai14 |
| B6(Cg)-Foxp2tm1.1Sfis/CfreJ | The Jackson Labtorary | 026259 | Foxp2fl/fl |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline | Corning cellgro | 21-030-CVR |
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