नमूना रणनीतियों और सुअर का बायोमेडिकल मॉडल से जैव बैंक ऊतक नमूनों की प्रोसेसिंग
Summary
व्यावहारिक आवेदन और एक व्यापक स्पेक्ट्रम के लिए सुअर का पशु मॉडलों के प्रतिनिधि ऊतक नमूनों के उत्पादन के लिए तरीकों के प्रदर्शन के प्रवाह का विश्लेषण के लिए एक बैंक परियोजनाओं में volumetry, व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना सहित, प्रदर्शन कर रहे हैं, और गुणात्मक और मात्रात्मक सुघड़ और आणविक विश्लेषण प्रकारों के लिए ऊतक नमूनों के विभेदक प्रसंस्करण.
Abstract
शोधों में चिकित्सा अनुसंधान में सुअर का मॉडल तेजी से अधिक लोकप्रिय हो गए हैं । व्यक्तिगत पशुओं के उच्च मूल्य, विशेष रूप से आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर मॉडल, और इन मॉडलों के उपलब्ध पशुओं की अक्सर सीमित संख्या को ध्यान में रखते हुए, पर्याप्त संसाधित ऊतक नमूनों की स्थापना (बैंक) के संग्रह के लिए उपयुक्त एक नमूना के समय बिंदु पर निर्दिष्ट नहीं विश्लेषण सहित अनुवर्ती विश्लेषण विधियों, के व्यापक स्पेक्ट्रम, मॉडल के शोधों के मूल्य का पूरा लाभ लेने के लिए सार्थक दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करते हैं । सुअर का एनाटॉमी की ख़ासियत के संबंध में, व्यापक दिशा-निर्देश हाल ही में विभिन्न सुअर का अंगों और ऊतकों से प्रतिनिधि, उच्च गुणवत्ता के नमूनों की मानकीकृत पीढ़ी के लिए स्थापित किया गया है. ये दिशानिर्देश परिणामों के reproducibility और विभिंन अध्ययनों और जांचकर्ताओं के बीच उनकी तुलना के लिए आवश्यक पूर्वापेक्षाएं हैं । इस तरह के अंग वजन और मात्रा के रूप में बुनियादी डेटा की रिकॉर्डिंग, नमूना स्थानों के निर्धारण और ऊतक के नमूनों की संख्या के रूप में अच्छी तरह के रूप में उनके अभिविन्यास, आकार, प्रसंस्करण और छंटनी दिशाओं, प्रासंगिक कारक हैं उत्पन्न किया जा करने के लिए आणविक, गुणात्मक, और मात्रात्मक रूपात्मक विश्लेषण के लिए सामांयीकरण और नमूना के प्रयोज्य का निर्धारण । यहां, एक उदाहरण के लिए, व्यावहारिक, प्रतिनिधि की पीढ़ी के लिए सबसे महत्वपूर्ण तकनीक का कदम दर कदम प्रदर्शन, बहुउद्देश्यीय सुअर का ऊतकों से बैंक नमूना प्रस्तुत की है । यहां वर्णित तरीके अंग/ऊतक की मात्रा और घनत्व का निर्धारण, बिंदु गिनती द्वारा parenchymal अंगों के लिए एक मात्रा भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना प्रक्रिया के आवेदन, ऊतक संकोचन की हद तक का निर्धारण शामिल नमूनों की ऊतकवैज्ञानिक एंबेडिंग, और मात्रात्मक stereological विश्लेषण के लिए बेतरतीब ढंग से उन्मुख नमूनों की पीढ़ी, जैसे आइसोट्रोपिक वर्दी यादृच्छिक (IUR) वर्गों द्वारा उत्पंन “Orientator” और “Isector” तरीकों, और ऊर्ध्वाधर वर्दी यादृच्छिक (VUR) वर्गों ।
Introduction
अनुवाद चिकित्सा में, सूअरों बड़े पशु मॉडल1,2,3,4,5के रूप में उपयोग के लिए तेजी से आम हैं, सुअर का और के बीच कई लाभप्रद समानताएं के कारण मानव शरीर रचना विज्ञान और फिजियोलॉजी, और स्थापित आणविक जैविक रोग की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए सिलवाया, आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर मॉडल की पीढ़ी के लिए अनुमति देने के तरीकों की उपलब्धता1,4।
हालांकि, कुतर मॉडलों की तुलना में, किसी भी समय प्रयोगों के लिए प्रदान किया जा सकता है कि एक संबंधित सुअर मॉडल के पशुओं की संख्या सीमित है । यह लगभग एक वर्ष की सुअर का पीढ़ी के अंतराल के कारण है, और सुअर का मॉडल और पशुपालन की पीढ़ी के लिए आवश्यक वित्तीय और समय गहन प्रयास । इसलिए, एक सुअर का मॉडल के व्यक्तिगत पशुओं, साथ ही नमूनों कि इन सूअरों से उत्पंन किया जा सकता है, बहुत मूल्यवान हैं, विशेष रूप से अगर आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर का मॉडल और/या दीर्घकालिक प्रयोगात्मक मुद्दों(उदा, की देर जटिलताओं जीर्ण रोग) आयु वर्ग के व्यक्तियों2,6,7में जांच की जाती है ।
किसी भी अध्ययन के पाठ्यक्रम में, अतिरिक्त विश्लेषण जो अध्ययन के प्रारंभिक प्रयोगात्मक डिजाइन में निर्धारित नहीं किया गया था के प्रदर्शन बाद में बाहर बारी के लिए प्रासंगिक हो सकता है, उदा, अलग से उत्पंन होने वाले प्रश्नों का पता पहले से पता चला अप्रत्याशित निष्कर्षों । यदि ऐसे अतिरिक्त प्रयोगों के लिए उपयुक्त नमूने उपलब्ध नहीं हैं, पैस उच्च लागत और समय पर गहन व्यय अतिरिक्त सूअरों और ऊतक के नमूने उत्पन्न करने के लिए आवश्यक हो सकता है. इस तरह की हालात के लिए तैयार रहने के लिए, विभिन्न अंगों, ऊतकों, या जैव-तरल पदार्थ, मात्रात्मक और गुणात्मक रूप से अनुवर्ती विश्लेषणों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त के नमूने, संरक्षित बैक-अप के बायो बैंक संग्रह की पीढ़ी, एक महत्वपूर्ण माना जाता है एप्रोच2,6,7. एक सुअर का पशु मॉडल से इष्टतम लाभ प्राप्त करना, पर्याप्त जैव बैंक नमूनों की उपलब्धता भी बहुत ही में एक बहु अंग स्तर पर समान नमूना सामग्री पर विभिन्न विश्लेषण विधियों की एक व्यापक स्पेक्ट्रम प्रदर्शन करने के लिए अद्वितीय संभावना प्रदान करता है व्यक्तिगत जानवरों, उदा, विभिंन काम कर रहे समूहों के वैज्ञानिकों को नमूनों के वितरण से एक अनुसंधान नेटवर्क2,6,7में आयोजित किया । इसके अतिरिक्त, एक अध्ययन में जरूरत पशुओं की संख्या में कमी करने के लिए भी ‘ ‘ आगे दिखने ‘ ‘ की सैंपलिंग की रणनीति में एक बैंकर का योगदान है । सुअर का मॉडल के लाभ में हाल ही में एक बहु अंग, multiomics अध्ययन में प्रदर्शन किया गया है, दीर्घकालिक मधुमेह के एक आनुवंशिक रूप से संशोधित सुअर का मॉडल में अंग पार बात की जांच, ंयूनिख MIDY सुअर से नमूनों का उपयोग कर बैंक 2.
वहां कुछ अनिवार्य आवश्यकताओं को आम तौर पर प्रदर्शन विश्लेषण के परिणामों की विश्वसनीयता और व्याख्याता स्थापित करने के साथ अनुपालन करना चाहिए । नमूने reproducibly उत्पन्न किया जाना चाहिए, और वे प्रतिनिधि होना चाहिए, यानी, पर्याप्त रूप से रुचि रूपात्मक और ऊतक के आणविक सुविधाओं को प्रतिबिंबित/नमूने7से लिए गए थे । अनुप्रवाह विश्लेषण प्रकारों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त होने के लिए, नमूनों को पर्याप्त मात्रा में लिया जाना चाहिए और विभिन्न विश्लेषणात्मक विधियों के (समय और तापमान की स्थिति सहित) मांगों के अनुसार संसाधित किया जाना चाहिए, जिसमें वर्णनात्मक histopathological िरा, जैसे cryohistology, आयल और प्लास्टिक प्रोटोकॉल, immunohistochemistry, में सीटू संकरण, ultrastructural इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपिक विश्लेषण, और नैदानिक प्रयोगशाला नैदानिक विश्लेषण, साथ ही आणविक डीएनए, आरएनए, प्रोटीन, और चयापचयों का विश्लेषण ।
इस तरह की संख्या, मात्रा, लंबाई, या मात्रात्मक stereological विश्लेषण द्वारा अलग ऊतक संरचनाओं की सतह क्षेत्रों के रूप में अलग मात्रात्मक रूपात्मक मानकों की एक विस्तृत श्रृंखला के आकलन के लिए अनुमति देने के लिए, यादृच्छिक धारा विमानों की संबंधित अंगों/ऊतकों के ऊतकवैज्ञानिक नमूने7,8,9,10,11के लिए तैयार किए जाने की जरूरत है । मात्रात्मक रूपात्मक अध्ययनों में, ऊतक, अंग, या अंग डिब्बे की कुल मात्रा का सटीक निर्धारण, नमूनों (यानी, संदर्भ अंतरिक्ष) से लिया गया है महत्वपूर्ण महत्वपूर्ण है7,9 , 12 संबंधित अंग, ऊतक, या जीव के भीतर रुचि मानकों की पूर्ण मात्रा की गणना करने के लिए । अंततः, ऊतकवैज्ञानिक अनुभागों को तैयार करने के दौरान एंबेडिंग से संबंधित ऊतक संकोचन का प्रभाव निर्धारित किया जा सकता है और13खाते में लिया जाता है । इसलिए, मात्रात्मक stereological विश्लेषण, विशेष रूप से संग्रहीत नमूनों की (निश्चित ऊतक के नमूने, एम्बेडेड ऊतक ब्लॉक, ऊतकवैज्ञानिक वर्गों, आदि) पिछले अध्ययनों से कभी भी गंभीर रूप से सीमित हैं या असंभव12, विशेष रूप से यदि संबंधित अंगों की volumetry/ऊतकों का प्रदर्शन नहीं किया गया, यदि कोई पर्याप्त नमूना डिजाइन के प्रतिनिधि नमूने वारंट के लिए लागू किया गया, संख्या और उपलब्ध व्यक्तिगत नमूनों की मात्रा अपर्याप्त हैं, या यदि के प्रसंस्करण नमूने के ब्याज मात्रात्मक रूपात्मक पैरामीटर (s) के अनुमान के साथ असंगत है । कई गुना संभव कारकों को प्रभावित करने के कारण, संग्रह की उपयुक्तता-अलग मात्रात्मक रूपात्मक मापदंडों के विश्लेषण के लिए नमूना सामग्री स्पष्ट जवाब नहीं किया जा सकता है, लेकिन प्रत्येक व्यक्ति के मामले के सावधान आकलन पर निर्भर करता है ।
इस प्रकार, स्थान के रूप में, आकार, संख्या, प्रसंस्करण, छंटनी की दिशा, और नमूनों का उन्मुखीकरण संभवतः बाद के विश्लेषण के परिणामों को प्रभावित करेगा, इन कारकों काफी महत्व के हैं और किसी भी अध्ययन के प्रायोगिक डिजाइन में विचार किया जाना चाहिए. इन पहलुओं और सुअर का एनाटॉमी की विशेष सुविधाओं के संबंध में, व्यापक, विस्तृत, सुअर का पशु मॉडल के लिए अनुकूलित बड़े पैमाने पर नमूना दिशा निर्देशों हाल ही में स्थापित किया गया है, मानकीकृत, reproducible के लिए एक मजबूत संदर्भ प्रदान , और निरर्थक, पर्याप्त रूप से संसाधित, 50 से अधिक विभिंन सुअर का अंगों और ऊतकों 6, 7 से उच्च गुणवत्ता के नमूनों की कुशल पीढ़ी ।
methodological विवरण और वीडियो ट्यूटोरियल वर्तमान लेख में दिखाया विस्तृत, उदाहरण के लिए, सुबोध, volumetry के लिए तकनीक की एक किस्म के व्यावहारिक प्रदर्शन के लिए कदम से कदम निर्देश, सुअर का ऊतकों के नमूने और अंगों, और अलग बहाव विश्लेषण विधियों के लिए ऊतक के नमूनों की प्रोसेसिंग । विशेष रुप से प्रदर्शित तकनीकों में अंग के निर्धारण के लिए तरीके/ऊतक की मात्रा और आर्किमिडीज और Cavalieri9के सिद्धांतों के आधार पर घनत्व, जिनमें से संबंधित ऊतक के तीन आयामी संकोचन के आयामों का निर्धारण शामिल है ऊतकवैज्ञानिक परीक्षा के लिए प्रसंस्करण के दौरान विभिन्न embedding मीडिया में14 embedding, व्यवहार्य मात्रा के आवेदन-भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना दृष्टिकोण, अलग अनुवर्ती के लिए नमूना ऊतक नमूनों के प्रसंस्करण विश्लेषण7,8,9,15, और संभावित मात्रात्मक stereological विश्लेषण के लिए उचित उंमुख और संसाधित नमूनों की पीढ़ी7,8, 9,10,11. सुअर का में उनके आवेदन के लिए अगले बैंक परियोजनाओं, प्रदर्शन तरीके आम तौर पर सभी अध्ययन मात्रात्मक histo-अंगों के रूपात्मक गुणों/ऊतकों की जांच के लिए उपयुक्त हैं । इसके अलावा, व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना डिजाइन आणविक विश्लेषण तरीकों का उपयोग कर के बहुतायत परिवर्तन का पता लगाने के लिए प्रयोग में प्रतिनिधि नमूने की पीढ़ी के लिए विशेष रूप से फायदेमंद होते हैं, जैसे, RNAs, प्रोटीन, या चयापचयों में विभिंन अंगों और ऊतकों ।
अगले पैराग्राफ इन पद्धतियों के लिए एक संक्षिप्त परिचय प्रदान करते हैं, जबकि उनके व्यावहारिक प्रदर्शन प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित है ।
अंग/ऊतक की मात्रा का निर्धारण
अंग वजन और मात्रा का निर्धारण कई प्रयोगात्मक सेटिंग्स में महत्वपूर्ण है, के रूप में इन कारकों परिवर्तन का संकेत हो सकता है, संभावित रूप से प्रयोग के लिए ब्याज की जांच कारकों से संबंधित । एक अंग/ऊतक की कुल मात्रा भी सामांयतः पूर्ण मात्रात्मक मापदंडों की गणना करने के लिए आवश्यक है, (उदा., कुल सेल संख्या), stereologically से अनुमानित संख्यात्मक मात्रा घनत्व (यानी, प्रति वॉल्यूम कोशिकाओं की संख्या इकाई ऊतक के)7,12। इसके अलावा तकनीक से जटिल तकनीकी उपकरण का उपयोग कर, कंप्यूटर टोमोग्राफी के रूप में, वहां मूलतः तीन व्यावहारिक सामांयतः एक अंग या ऊतक की पूर्ण मात्रा निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया तरीके हैं । किसी अंग की मात्रा को “प्रत्यक्ष volumetric माप” द्वारा आर्किमिडीज के सिद्धांत के अनुसार निर्धारित किया जा सकता है, अर्थात, पूरी तरह जलमग्न होने पर संरचना द्वारा पानी या खारा विस्थापित की मात्रा को मापने । हालांकि, तुलना बड़े सुअर का अंगों के लिए, इन दृष्टिकोण अव्यावहारिक और अस्पष्टता से ग्रस्त हैं, क्योंकि वे बहुत बड़ी volumetric की आवश्यकता/ अधिक आसानी से, एक अंग की मात्रा/ऊतक अपने वजन और घनत्व7,12,16, जो कुशलतापूर्वक “डुबकी विधि”7का उपयोग कर निर्धारित किया जा सकता है से गणना की जा सकती है12 ,16 (प्रोटोकॉल चरण 1.1.) । अंग/ऊतक की मात्रा भी Cavalieri के “सिद्धांत” (1598-1647) के आधार पर volumetry दृष्टिकोण का उपयोग कर अनुमान लगाया जा सकता है । सरल शब्दों में, Cavalieri सिद्धांत राज्यों, कि अगर दो वस्तुओं एक जमीन विमान के समानांतर विमानों में खोदी गई हैं, और वर्गों की प्रोफाइल जमीन विमान से इसी दूरी पर दो वस्तुओं के माध्यम से कटौती एक ही क्षेत्रों है, दो वस्तुओं एक ही मात्रा है । इस प्रकार, मनमाने ढंग से आकार की वस्तुओं की मात्रा समानांतर, समान रूप से दूर अनुभाग विमानों और खंड विमानों के बीच की दूरी में उनके अनुभाग प्रोफ़ाइल क्षेत्रों के उत्पाद के रूप में अनुमान लगाया जा सकता है । यह निम्नलिखित सादृश्य के साथ सुबोध है: दो समान सिक्के की एक ही संख्या से मिलकर ढेर पर विचार पक्ष द्वारा पक्ष रखा जाता है, एक सिक्के अर्दली एक दूसरे के शीर्ष पर खड़ी के साथ ढेर सिक्के के ढेर के एक बेलनाकार आकार उपज, और अंय ऑफ सेंटर तैनात सिक्कों के साथ सिक्कों के ढेर (आंकड़ा 3ए) । हालांकि दोनों सिक्के के ढेर की आकृतियाँ अलग हैं, उनके वॉल्यूम एक ही हैं, दोनों स्टैक के अनुरूप स्तरों पर सिक्के के क्षेत्रों (यानी, समानांतर वर्गों की प्रोफाइल के क्षेत्रों से बराबर दूरी में दोनों सिक्का ढेर के माध्यम से कटौती जमीन) समान हैं । सुअर का अंगों और Cavalieri सिद्धांत का उपयोग कर ऊतकों की मात्रा का आकलन 7, 12, 15 चरण 1.2 में वर्णित है ।
ऊतकवैज्ञानिक embedding से संबंधित ऊतक संकोचन की सीमा का निर्धारण
ऊतकवैज्ञानिक ऊतक वर्गों में मापा कई मात्रात्मक रूपात्मक मापदंडों के विश्लेषण में, प्रोटोकॉल के लिए ऊतक प्रसंस्करण के दौरान होने वाली embedding संबंधित ऊतक संकोचन के प्रभाव को निर्धारित किया है और खाते में लिया जाना है । एंबेडिंग से संबंधित ऊतक संकोचन की हद तक चर सकता है, और ऊतक, इसके प्रसंस्करण, और embedding मध्यम8,13,17,18,19पर निर्भर करता है । आम तौर पर, एक ऊतक नमूने की मात्रा के embedding से संबंधित परिवर्तन (यानी, ज्यादातर संकोचन) अंतरिक्ष के सभी तीन आयामों में होते हैं, और, इसलिए, मात्रात्मक stereological विश्लेषण द्वारा अनुमानित सभी आयामी मापदंडों को प्रभावित करताहै8 . मूलतः, embedding से संबंधित ऊतक संकोचन की हद तक, रैखिक ऊतक संकोचन कारक के रूप में व्यक्त (एफएस), के रूप में कदम 1.3 में दिखाया अनुमान लगाया जा सकता है. और के सुधार के लिए इस्तेमाल किया (सिकुड़ना-संवेदनशील) मात्रात्मक रूपात्मक पैरामीटर14.
अंगों/ऊतकों की मात्रा-भारित व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना
सुअर का अंग के एक बैंक के संग्रह की स्थापना के लिए/ऊतक के नमूने, इस तरह के चरण 2 में वर्णित के रूप में वजन व्यवस्थित यादृच्छिक नमूना दृष्टिकोण साबित किया है व्यावहारिक, समय की बचत, और प्रतिनिधि की पीढ़ी के लिए कुशल तकनीक, बहुउद्देश्यीय ऊतक के नमूने7,8,9,15.
आइसोट्रोपिक वर्दी की पीढ़ी यादृच्छिक वर्गों और ऊर्ध्वाधर वर्दी मात्रात्मक stereological विश्लेषण के लिए यादृच्छिक वर्गों
एक पर्याप्त रूप से तैयार नमूना के बिना निर्धारित नहीं किया जा सकता है कि मानकों की एक अधिकतम के आकलन के लिए विभिन्न मात्रात्मक stereological विश्लेषण विधियों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए उपयुक्त होने की जरूरत है. लगभग सभी मात्रात्मक stereological मापदंडों “आइसोट्रोपिक (स्वतंत्र) वर्दी यादृच्छिक (IUR) वर्गों”8,9का उपयोग कर, निर्धारित किया जा सकता है । IUR वर्गों में, ऊतक नमूने की धारा विमान के तीन आयामी अभिविन्यास यादृच्छिक है. इस खंड विमान की स्थिति के सापेक्ष ऊतक नमूने की स्थिति के यादृच्छिकीकरण द्वारा प्राप्त किया जा सकता है, के रूप में लागू “Isector” विधि11 (प्रोटोकॉल कदम 3.1), या खंड विमान के उंमुखीकरण के सापेक्ष यादृच्छिकीकरण द्वारा ऊतक नमूना, के रूप में “Orientator” विधि10 (प्रोटोकॉल चरण 3.2) । ऊतक के नमूनों में, जैसे त्वचा या म्यूकोसा एक स्वाभाविक रूप से मौजूद है, या परिभाषित और ठीक से पहचाने जाने योग्य ऊर्ध्वाधर धुरी प्रदर्शित नमूना, “ऊर्ध्वाधर वर्दी यादृच्छिक (VUR) वर्गों की तैयारी” (प्रोटोकॉल कदम 3.3.) कड़ाई से विमान के भीतर खोदी उनकी अनुलंब अक्ष लाभप्रद8,20है । IUR की सैद्धांतिक नींव की एक पूरी बहस के लिए/VUR नमूना और संभावित बहाव मात्रात्मक stereological विश्लेषण की एक व्यापक चर्चा, रुचि पाठक जीवन में मात्रात्मक stereology की पाठ्यपुस्तकों के लिए भेजा जाता है विज्ञान8,9.
Protocol
Representative Results
Discussion
सुअर का पशु मॉडल से बैंक नमूना संग्रह की पीढ़ी के अंग के निर्धारण के लिए मजबूत तकनीक और प्रोटोकॉल की आवश्यकता है/ऊतक की मात्रा, प्रतिनिधि की reproducible पीढ़ी, निरर्थक ऊतक नमूनों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने उत्कृष्ट तकनीकी सहायता के लिए लिसा Pichl का शुक्रिया अदा किया ।
Materials
| Agar | Carl Roth GmbH, Germany | Agar (powder), Cat.: 5210.3 | Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves. |
| Caliper | Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany | Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902 | Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well. |
| Casting molds (metal) | Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany | Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b | Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well. |
| Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) | n.a. | n.a. | Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al. Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016) |
| Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles | n.a. | n.a. | Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013). |
| Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm) | Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China | Y10006 and Y10005 | Any other type of standard office foldback clamps will do as well. |
| Forceps (anatomical) | NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811 | Any type of anatomical forceps will do. |
| Formaldehyde-solution 4% | SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany | Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005 | Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves. |
| Graph paper (for calibration) | Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de | Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514 | Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do. |
| Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml) | NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036 | Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do. |
| Laboratory scale(s) | Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany | PM6000 | Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do |
| Sartorius AG, Göttingen, Germany | BP61S | ||
| Microtome blades | Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany | FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700 | Any kind of single-use microtome blades will do. |
| Morphometry/planimetry software/system | National Institute of Health (NIH) | ImageJ | Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997). |
| Zeiss-Kontron, Eching, Germany | VideoplanTM image analysis system | Out of stock | |
| Photo camera | Nikon | D40 | Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod will do. |
| Plastic transparencies | Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany | Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.: 3562 | Any (laser)-printable plastic transparency will do. |
| Random number tables | n.a. | n.a. | Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/ |
| Razor blades | Plano GmbH, Wetzlar, Germany | T5016 | Any kind of razor blades will do. |
| Ruler | Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de | Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30 | Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well. |
| Saline (0.9%) | Carl Roth GmbH, Germany | Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1 | To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C. |
| Scalpel blades | Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany | BRAUN Surgical blades N°22 | Any kind of scalpel blades will do. |
| Scanner | Hewlett-Packard | hp scanjet 7400c | Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do. |
| Slicing devices | n.a. | n.a. | Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al. Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016). |
| Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter) | Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany | Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm | Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections) |
| Thin wire | Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de | Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742 | Any other kind of thin wire will also do. |
| Tissue paper | NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany | Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305 | Any other kind of laboratory tissue paper will do as well. |
| Waterproof pen | Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany | Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2 | Any other kind of waterproof pen will do as well. |
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