Стратегий выборки и обработки образцов ткани биобанка из свинины биомедицинской модели

Summary

Демонстрируются практического применения и производительности методов для генерации образцы представительной ткани свинину животных моделей для широкого спектра течению анализов в биобанке проектов, включая volumetry, систематического случайной выборки, и дифференциальный обработка образцов ткани для качественных и количественных анализов молекулярных и морфологических типов.

Abstract

В трансляционного медицинских исследований свинину модели постепенно становятся более популярными. Учитывая высокую ценность отдельных животных, особенно генетически модифицированных свиней, модели и часто ограниченное количество доступных животных этих моделей, создание коллекций (биобанке) образцов должным образом обработанной ткани подходит для широкий спектр последующий анализ методов, включая анализ, не указанный на этапе отбора проб, представляют собой значимые подходы в полной мере воспользоваться трансляционная значения модели. Отношении особенности свинину анатомии недавно были установлены всеобъемлющие руководящие принципы для стандартизированных поколения представителя, высокое качество образцов из разных свинину органов и тканей. Эти руководящие принципы являются необходимыми условиями для воспроизводимости результатов и их сопоставимости между различными исследованиями и следователей. Запись основных данных, таких как орган весов и томов, определение мест отбора проб и количество образцов ткани будет создан, а также их ориентацию, размер, обработки и направления обрезки, являются соответствующие факторы определение обобщения и удобство образца для молекулярной, качественные и количественные морфологического анализа. Здесь наглядные, практические, шаг за шагом демонстрация самых важных методов для поколения представителя, представлен многоцелевой биобанке образца от свиного тканей. Описанные здесь методы включают в себя определение органа/ткани томов и плотности, применение процедуры средневзвешенная по объему систематического выборочного Паренхиматозный органов путем подсчета точки, определение степени усадки ткани связанные с гистологическим внедрение образцов, и поколения произвольно ориентированный образцов для количественных стереологических анализов, например изотропной единообразных случайных (IUR) секции, создаваемые методы «Ориентатор» и «Isector» и вертикальная форма случайные (VUR) секций.

Introduction

В трансляционной медицины, свиньи чаще для использования крупных животных моделей^1,2,3,4,5, благодаря несколько выгодных сходство между свинину и человеческой анатомии и физиологии и наличие установленных молекулярно-биологических методов, позволяя для поколения с учетом, генетически модифицированных свиней модели для широкого спектра болезней условия^1,4.

Однако по сравнению с моделями грызунов, количество животных соответствующих свинья модель, которая может быть предоставлена для экспериментов в любое время ограничено. Это обусловлено свинину поколения интервал примерно один год, и финансовых и время интенсивных усилиях, необходимых для генерации свинину моделей и животноводства. Таким образом отдельные животные модель свинину, а также образцы, которые могут быть сгенерированы из этих свиней, являются очень ценным, особенно если генетически модифицированных свиней модели и/или долгосрочных экспериментальных вопросов (например, поздних осложнений хронические заболевания) рассматриваются в возрасте лица^2,6,7.

В ходе любого исследования, проведения дополнительных анализов, которые не были запланированы в первоначальный экспериментальный дизайн исследования позднее может оказаться актуальными, например, адрес, различные вопросы, возникающие в связи с ранее обнаружил неожиданные результаты. Если подходящие образцы для таких дополнительных экспериментов не доступны, непропорционально высокой стоимости и расходов много времени может потребоваться для создания дополнительных свиней и образцы тканей. Быть готовы к таким событиям, генерации биобанке коллекции сохраняется резервные образцов различных органов, тканей или био жидкости, количественно и качественно подходит для широкого круга последующих анализов, считается важным подход^2,6,7. Получения оптимальных выгод от свиней животные модели, наличие адекватных биобанке образцов также предлагает уникальную возможность выполнить широкий спектр методов анализа различных на идентичных образцов материалов на уровне нескольких орган в тот же отдельных животных, например, путем распространения образцов для ученых различных рабочих групп, организованных в исследовательской сети^2,6,7. Кроме того ” перспективных ” выборки стратегия в biobanking также способствует уменьшению числа животных, нуждается в исследовании. Преимущества свинину модель biobanking недавно были продемонстрированы в нескольких орган, multiomics исследование, изучение орган кросс talk в генетически модифицированных свинину модели долгосрочного сахарный диабет, с использованием образцов из Мюнхена MIDY свинья биобанке ².

Есть некоторые обязательные требования, которые биобанке образцы обычно должны соответствовать для установления надежности и интерпретируемость результаты впоследствии проведенных анализов. Образцы должны быть сгенерированы можно воспроизвести, и они должны быть представитель, т.е., адекватно отражающий заинтересованных молекулярных и морфологических особенностей ткани/органа образцы были взяты из⁷. Чтобы быть пригодным для широкого круга вниз по течению анализ типов, образцы должны в достаточных количествах и обработаны согласно требованиям (включая время и температурных условий) различных аналитических методов, включая описательный гистопатологические анализов, например cryohistology, парафин и пластиковые гистологии, иммуногистохимия, в situ гибридизация, микроскопические анализы ультраструктурных электрона и клинических лабораторных диагностических анализов, а также как молекулярные анализ ДНК, РНК, белков и метаболитов.

Чтобы для оценки широкого круга различных количественных морфологических параметров, таких как числа, томов, длины или площади поверхности различных тканевых структур путем количественного анализа стереологических, рандомизированных раздел самолетов Гистологические образцы соответствующих органов/тканей должны быть подготовлены^7,8,9,10,11. В количественных морфологических исследований, точное определение общего объема ткани, органа или органа отсека, образцы были взяты из (т.е., ссылка пространства) является критически важным^{7,9 , 12} для вычисления абсолютного количества заинтересованных параметров в пределах соответствующего органа, ткани или организма. В конце концов эффект встраивания связанных ткани усадки при подготовке Гистологические срезы должен быть определены и приняты во внимание¹³. Таким образом количественные стереологических анализ, особенно архивных образцов (фиксированная образцов тканей, блоков встроенного ткани, Гистологические срезы и т.д.) от предыдущих исследований, иногда серьезно ограничены или даже невозможным¹², особенно если volumetry соответствующих органов/тканей не выполняется, если не адекватные выборки были применены для репрезентативных выборок, если цифры и количества доступных отдельных примеров являются недостаточными или если обработка образцы несовместима с оценки количественных морфологических параметров, представляющих интерес. Из-за многочисленных возможных факторов пригодность архива образцы материалов для анализа различных количественных морфологических параметров нельзя однозначно ответить, но зависит от тщательной оценки каждого отдельного случая.

Таким образом как расположение, размер, номер, обработки, обрезки направления и ориентации образцов потенциально повлияет на результаты последующего анализа, эти факторы имеют большое значение и должны рассматриваться в экспериментальный дизайн любого исследования. Эти аспекты и особенности анатомии свинину, всеобъемлющий, подробный, крупномасштабные выборки руководящие принципы были созданы недавно адаптированы к свинине Животные модели, предоставляя надежные ссылки на стандартизированных, воспроизводимые и эффективное создание избыточных, адекватно обработанные, высокое качество образцов из более чем 50 различных свинину органов и тканей^6,7.

Методологические описания и видео учебник, показано в настоящей статье предоставляют подробные, иллюстративный, понятной, шаг за шагом инструкции для практического выполнения различных методов для volumetry, отбор проб свинину тканей и органы и обработка образцов ткани для различных течению анализа методов. Рекомендуемые методы включают в себя методы определения объемов ткани органов и плотности, основанные на принципах Архимеда и Кавальери⁹, включая определение размеров трехмерной усадка ткани, связанные с Встраивание в разных внедрения мультимедиа¹⁴ во время обработки для гистологического исследования, применение практически систематического случайной выборки, средневзвешенная по объему подходов, обработка образцов пробы ткани для различных последующих анализ^7,8,9,15и поколение надлежащим образом и обработанных образцов для потенциальных количественных анализов стереологических^{7,8, 9,10,11}. Рядом с их применения в проектах свинину биобанке продемонстрировали методы обычно подходят для всех исследований, изучения количественных гисто Морфологические свойства органов/тканей. Кроме того систематическое случайных выборок особенно полезно для создания репрезентативных выборок в эксперименте с использованием методов молекулярного анализа для обнаружения изменения в изобилии, например, РНК, белки или метаболитов в различные органы и ткани.

В следующий пунктах приводится краткое введение в эти методы, в то время как их практической эффективности описан в разделе протокол.

Определение объемов органа/ткани
Определение весов орган и тома имеет важное значение в нескольких экспериментальных установках, как эти факторы могут указывать на изменения, потенциально связанных с экспериментально изучались факторы интереса. Для вычисления абсолютных количественных параметров, (например, числа общей ячейки), от stereologically численные объем плотности (то есть, количество клеток на единицу объема также часто требуется общий объем органа/ткани ткани)^7,12. Помимо методов с использованием сложного технического оборудования, такие как компьютерная томография существуют в основном три практические методы, обычно используемые для определения абсолютный объем органа или ткани. Объем органа может определяться «прямого объемного измерения» согласно принципу Архимеда, т.е., измерения объема воды или физиологического раствора, перемещенных в результате структуры, когда полностью погружены. Однако соответствующе большие свинину органов, эти подходы являются непрактичными и склонны к неточности, так как они требуют очень больших объемных/измерительные колбы. Более удобно можно рассчитать объем органа/ткани от его веса и плотности^7,12,16, которые эффективно может быть определено, используя «метод погружения»^{7,12 ,16} (протокол шаг 1.1.). Ткани органов томов может быть оценена с помощью volumetry подходы, основанные на «принцип Кавальери» (1598 — 1647). В простых терминах Cavalieri принцип гласит, что если два объекта секционного в плоскостях, параллельных плоскости земли, и профили секций прорезать двух объектов на соответствующем расстояния от заземленной у тех же областях, два объекта у того же тома. Таким образом объем произвольной формы объектов может быть оценена как продукт их раздела профиля областях в параллельной, столь же далекой секущих плоскостей и расстояние между секущих плоскостей. Это приемлемые с следующую аналогию: рассмотреть два стека, состоящий из одинаковое количество идентичных монеты расположены бок о бок, один стек с монеты аккуратность, накладываются на друг друга, давая цилиндрическую форму монета стека, и другие стопка монет с-центр расположены монеты (рис. 3A). Хотя разные формы как монета стеки, их объемы совпадают, поскольку области монет на соответствующих уровнях обоих стеков (т.е., области профилей параллельных секций прорезать оба монета стеки в равных расстояниях от молотый) идентичны. Оценки объемов свинину органов и тканей, с использованием Cavalieri принцип^7,12,15 описано в шаге 1.2.

Определение степени усадки ткани, связанные с гистологическим внедрение
В анализ нескольких количественных морфологических параметров, измеряется в разделах ткани гистологических эффект встраивания связанных ткани усадка, происходящих во время обработки для Гистология ткани должен быть определены и приняты во внимание. Степень усадки встраивания связанных ткани может быть переменной и зависит как от ткани, ее обработки и внедрения средние^{8,13,,1718,19}. Как правило происходят встраивание связанные изменения объема образца ткани (т.е., главным образом усадки) во всех трех измерениях пространства, и, таким образом, затрагивает все размерные параметры оценкам количественных анализов стереологических⁸ . В принципе можно оценить степень внедрения связанных с ткани усадка, выраженный в виде линейной ткани коэффициент усадки (f_S), как показано в шаге 1.3. и используется для коррекции количественных морфологических параметров (усадка чувствительных)¹⁴.

Средневзвешенная по объему систематической выборки органов/тканей
Для создания биобанка коллекции образцов свинину органа/ткани средневзвешенная по объему систематического выборочного подходов, таких, как описано в шаге 2 оказались практический, экономящее время и эффективных методов для генерации представителя, многоцелевой ткани образцы^7,8,9,15.

Поколение изотропной единообразные случайной разделов и вертикальные единообразные случайной для количественного анализа, стереологических
Образцы тканей биобанке нужно быть подходит для широкого спектра различных количественных стереологических анализа методов для оценки максимум параметров, которые не могут быть определены без надлежащим образом подготовленного образца. Почти все количественные параметры стереологических можно определить, используя «изотропного (независимой) единообразные случайных (IUR) разделы»^8,9. В разделах IUR рандомизированных трехмерную ориентацию плоскости сечения образца ткани. Это может быть достигнуто путем рандомизации положения образца ткани относительно положения секущей плоскости, как применяется метод «Isector»¹¹ (протокол шаг 3.1), или путем рандомизации ориентации секущей плоскости относительно образец ткани, как и метод «Ориентатор»¹⁰ (протокол шаг 3.2). В образцах тканей, такие, как кожи или слизистой оболочки образца, показ естественным образом присутствуют, или определенных и правильно идентифицировать вертикальной оси, подготовка «вертикальный единообразных случайных (VUR) секций» (протокол шаг 3.3.) строго секционного в плоскости их Вертикальная ось является выгодным^8,20. Для полного дискурса теоретические основы выборки IUR/VUR и всеобъемлющего обсуждения потенциальных течению количественных стереологических анализов заинтересовавшийся читатель именуется учебники количественных stereology в жизни наук^8,9.

Protocol

Все методы, описанные здесь использовать образцы тканей, полученных от мертвых животных и полностью соответствуют нормам немецкой правовой защиты животных. 1. Volumetry Погружение техника для определения плотности ткани/орган (Рисунок 1 </st…

Representative Results

Метод погружения для определения плотности ткани/орган Рисунок 12А -B показывает, представитель определение плотности и объема свиные почки методом погружения, описанный в шаге 1.1 (рис. 1, <strong class="xf…

Discussion

Поколения биобанке образца коллекций из свиных животных моделей требуются надежные методы и протоколы для определения объемов органа/ткани, воспроизводимые поколения представителя, подходит для широкого круга образцов избыточной ткани анализ различных методов и для рандомизации ор…

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.