Strategie di campionamento e trattamento dei campioni di tessuto Biobank Porcine modelli biomedicale

Summary

Le applicazioni pratiche e le prestazioni dei metodi per la generazione di campioni di tessuto rappresentativo di porcini modelli animali per un ampio spettro di analisi a valle nella biobanca progetti sono dimostrati, tra cui volumetria, campionamento casuale sistematico, e trattamento differenziale dei campioni di tessuto per i tipi di analisi qualitative e quantitative morfologiche e molecolari.

Abstract

Nella ricerca medica traslazionale, porcini modelli costantemente sono diventati più popolari. Considerando l’alto valore dei singoli animali, specialmente di maiale geneticamente modelli e il numero spesso limitata di animali disponibili di questi modelli, creazione di raccolte di (biobanca) dei campioni di tessuto adeguatamente elaborato adatto per un ampio spettro di metodi di analisi successive, incluse le analisi non specificati nel punto del tempo di campionamento, rappresentano significativi approcci per sfruttare appieno il valore traslazionale del modello. Per quanto riguarda le peculiarità dell’anatomia suina, le linee guida complete recentemente sono state stabilite per generazione standardizzato di rappresentante, campioni di alta qualità da suini diversi organi e tessuti. Queste linee guida sono prerequisiti essenziali per la riproducibilità dei risultati e la loro comparabilità tra diversi studi e gli investigatori. La registrazione dei dati di base, come pesi dell’organo e volumi, la determinazione di punti di campionamento e il numero di campioni di tessuto da generare, come pure loro orientamento, dimensione, elaborazione e indicazioni di rifilatura, sono fattori rilevanti determinazione della generalizzabilità e usabilità del campione per analisi morfologiche molecolari, qualitative e quantitative. Qui, una dimostrazione illustrativa, pratica e dettagliata delle tecniche più importanti per la generazione del rappresentante, multi-purpose biobanca esemplare da tessuti di origine suine è presentato. I metodi descritti qui includono la determinazione dei volumi di organi/tessuti e densità, l’applicazione di una procedura di campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume per organi parenchimali di punto-conteggio, determinare l’entità del restringimento del tessuto legate alla inclusione istologici di campioni e generazione di campioni orientati casualmente per analisi stereologiche quantitative, come le sezioni di casuale uniforme isotropici (IUR) generate dai metodi “Orientatore” e “Isector” e uniforme verticale sezioni (RVU) casuale.

Introduction

In medicina traslazionale, maiali sono sempre più comuni per uso come animale di grandi dimensioni modelli^1,2,3,4,5, a causa di parecchie somiglianze vantaggiose tra il porcino e anatomia umana e fisiologia e la disponibilità di metodi biologici molecolari stabiliti permettendo per generazione di su misura, geneticamente modelli di maiale per una vasta gamma di condizioni di malattia^1,4.

Tuttavia, rispetto ai modelli del roditore, il numero di animali di un modello di rispettivi maiale che possono essere fornite per gli esperimenti in qualsiasi momento è limitato. Ciò è dovuto l’intervallo di generazione porcino di circa un anno e gli sforzi finanziari e richiedono molto tempo richiesti per la generazione di modelli porcine e zootecnia. Pertanto, singoli animali di un modello porcino, come pure i campioni che possono essere generati da questi suini, sono molto utili, specialmente se geneticamente porcine modelli e/o a lungo termine problemi sperimentali (ad esempio, le complicazioni ritardate di malattie croniche) sono esaminate in individui invecchiati^2,6,7.

Nel corso di qualsiasi studio, prestazioni di analisi aggiuntive che non era stata prevista nel progetto sperimentale iniziale dello studio più tardi potrebbero rivelarsi per essere rilevante, per esempio, all’indirizzo distinte domande derivanti da precedentemente scoperto risultati inattesi. Se non sono disponibili campioni idonei per tali ulteriori esperimenti, sproporzionatamente elevato costo e dispendiose spese potrebbero essere necessarie generare ulteriori maiali e campioni di tessuto. Per essere preparati per tali eventualità, generazione delle collezioni Biobanca di campioni di backup conservati di diversi organi, tessuti o bio-liquidi, quantitativamente e qualitativamente adatti per una vasta gamma di analisi successive, è considerato un importante approccio^2,6,7. I benefici ottimali la derivazione da un modello animale porcino, la disponibilità di campioni adeguati biobanca offre anche la possibilità unica per eseguire un’ampia gamma di metodi differenti di analisi sui materiali campione identico a livello multi-organo nella stessa singoli animali, per esempio, di distribuzione dei campioni agli scienziati di diversi gruppi di lavoro organizzati in una rete di ricerca^2,6,7. Inoltre, la strategia di campionamento ‘ lungimirante ‘ in biobanking contribuisce anche ad una riduzione del numero di animali necessari in uno studio. I vantaggi del modello porcino biobanking recentemente sono stati dimostrati in un multi-organo, multiomics studio, esaminante organo cross-talk in un modello porcino geneticamente di mellito di diabete a lungo termine, usando gli esemplari da Monaco di Baviera MIDY maiale biobanca ².

Ci sono alcuni requisiti obbligatori biobanca campioni generalmente devono rispettare per stabilire l’affidabilità e l’interpretabilità dei risultati delle analisi eseguite successivamente. I campioni devono essere generati in modo riproducibile, e devono essere adeguatamente rappresentante, cioè, che riflette le caratteristiche morfologiche e molecolari interessate dell’organo/tessuto sono stati prelevati i campioni da⁷. Per essere adatto per una vasta gamma di tipi di analisi a valle, i campioni devono essere presi in quantità sufficiente e trattati secondo le richieste (comprese le condizioni di tempo e temperatura) dei metodi analitici diversi, tra cui descrittivo analisi istopatologiche, come cryohistology, paraffina e plastica istologia, immunoistochimica, ibridazione in situ , analisi al microscopio elettronico ultrastrutturali e analisi diagnostiche di laboratorio clinico, anche come molecolare analisi del DNA, RNA, proteine e metaboliti.

Per consentire la valutazione di una vasta gamma di parametri morfologici quantitativi distinti quali numeri, volumi, lunghezze o superfici di strutture di tessuto distinti dalle analisi stereologiche quantitative, sezione randomizzato gli aerei della campioni istologici dei rispettivi organi/tessuti devono essere preparati^7,8,9,10,11. In studi morfologici quantitativi, la determinazione precisa del volume totale del tessuto, organo o vano di organo, i campioni sono stati prelevati da (cioè, lo spazio di riferimento) è fondamentalmente importante^{7,9 , 12} per calcolare le quantità assolute dei parametri interessati entro il rispettivo organo, tessuto o organismo. Alla fine, l’effetto di restringimento di incorporamento-relative del tessuto durante la preparazione delle sezioni istologiche deve essere determinato e presi in considerazione¹³. Pertanto, analisi quantitative stereologiche, soprattutto di campioni archiviati (fissata i campioni di tessuto, tessuto incorporato blocchi, sezioni istologiche, ecc.) da studi precedenti sono a volte severamente limitata o addirittura impossibile¹², specialmente se volumetria dei rispettivi organi/tessuti non è stata eseguita, se non disegni di campionamento adeguato sono stati applicati per mandato campioni rappresentativi, se i numeri e le quantità di campioni singoli disponibili non sono sufficienti, o se l’elaborazione della campioni è incompatibile con la valutazione dei parametri morfologici quantitativi di interesse di. A causa di molteplici fattori d’influenzano possibili, l’idoneità dei materiali di archivio-campione per l’analisi dei parametri morfologici quantitativi distinti non può essere risolta in modo inequivocabile, ma dipende la valutazione attenta di ogni singolo caso.

Così, come la posizione, dimensioni, numero, elaborazione, direzione di taglio e orientamento dei campioni potenzialmente influenzerà i risultati delle analisi successive, questi fattori sono di grande importanza e devono essere considerati nel disegno sperimentale di qualsiasi studio. Per quanto riguarda questi aspetti e le caratteristiche speciali dell’anatomia suina, linee guida di campionamento completo, dettagliato, su larga scala modelli animali adattati a suina recentemente sono stati stabiliti, fornendo un robusto riferimento standardizzato, riproducibile e generazione efficiente di campioni ridondanti, adeguatamente elaborati, di alta qualità da più di 50 diverse specie suina organi e tessuti^6,7.

Le descrizioni metodologiche e il video tutorial illustrato nel presente articolo forniscono dettagliate, illustrativi, comprensibile, passo a passo le istruzioni per esecuzione pratica di una varietà di tecniche per volumetria, campionamento dei tessuti suine e organi e trattamento dei campioni di tessuto per metodi differenti di analisi a valle. Le tecniche consigliate includono metodi per la determinazione dei volumi di organi/tessuti e densità sulla base dei principi di Archimede e Cavalieri⁹, compresa la determinazione delle dimensioni del restringimento tridimensionale del tessuto relativo alla incorporamento in diversi incorporamento media¹⁴ durante l’elaborazione per esame istologico, applicazione del campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume praticabile si avvicina, elaborazione di campioni di tessuto campionata per diverse successive analisi^7,8,9,15e generazione di opportunamente orientato ed elaborati campioni per potenziali analisi quantitative stereologiche^{7,8, 9,10,11}. Accanto a loro applicazione nei progetti di porcino biobanca, i metodi hanno dimostrati sono generalmente adatti per tutti gli studi che esaminano proprietà quantitativa histo-morfologiche di organi/tessuti. Inoltre, disegni di campionamento casuale sistematico sono particolarmente utili per la generazione di campioni rappresentativi in esperimenti utilizzando metodi di analisi molecolare per rilevare alterazioni di abbondanza di, per esempio, RNA, proteine o metaboliti in vari organi e tessuti.

I prossimi paragrafi forniscono una breve introduzione a questi metodi, mentre loro prestazioni funzionali sono descritto nella sezione protocollo.

Determinazione dei volumi di organi/tessuti
Determinazione dei volumi e pesi dell’organo è importante in diverse impostazioni sperimentali, come questi fattori potrebbero indicare cambiamenti, potenzialmente correlati al sperimentalmente esaminati fattori di interesse. Il volume totale di un organo/tessuto è anche comunemente richiesto per il calcolo di parametri quantitativi assoluti, (ad esempio, il numero totale delle cellule), dalle densità numerica stereologically stima del volume (cioè, il numero di celle per unità di volume del tessuto)^7,12. Oltre alle tecniche utilizzando attrezzature tecniche complesse, quali tomografia del calcolatore, ci sono fondamentalmente tre metodi pratici comunemente utilizzate per determinare il volume assoluto di un organo o tessuto. Il volume di un organo può essere determinato da “diretto misura volumetrica” secondo il principio di Archimede, cioè, misurazione del volume di acqua o soluzione salina spostato dalla struttura quando completamente sommerso. Tuttavia, per in modo paragonabile grandi organi porcini, questi approcci sono poco pratico e incline a imprecisione, poiché richiedono molto grande/misurazione volumetrica boccette. Più convenientemente, il volume di un organo/tessuto può essere calcolato dal suo peso e densità^7,12,16, che può essere determinato in modo efficiente utilizzando il “metodo di immersione”^{7,12 ,16} (passaggio di protocollo 1.1.). Volumi di organo/tessuto possono inoltre essere stimate utilizzando la volumetria approcci basati sul “principio di Cavalieri” (1598-1647). In termini semplici, afferma il principio di Cavalieri, che, se due oggetti sono sezionati in piani paralleli ad un piano terra, e i profili delle sezioni tagliano attraverso i due oggetti alle corrispondenti distanze dal piano di terra hanno le stesse aree, i due oggetti hanno lo stesso volume. Quindi, il volume degli oggetti di forma arbitraria può essere valutato come il prodotto delle loro zone di profilo di sezione in sezione parallela, altrettanto lontani gli aerei e la distanza tra i piani di sezione. Questo è comprensibile con la seguente analogia: considera due stack composto lo stesso numero di monete identiche sono collocati fianco a fianco, uno stack con l’inserviente di monete impilata una sopra l’altra producendo una forma cilindrica dello stack delle monete e l’altro pila di monete con fuori centro posizionato monete (Figura 3A). Anche se le forme di entrambi gli stack di moneta sono diverse, i volumi sono gli stessi, poiché le zone delle monete a livelli corrispondenti di entrambi gli stack (vale a dire, le aree di profili di sezioni parallele tagliano attraverso entrambi gli stack di moneta a distanze uguali dalla terra) sono identici. Stima dei volumi di porcini organi e tessuti utilizzando il principio di Cavalieri^7,12,15 è descritto al punto 1.2.

Determinazione del grado di restringimento del tessuto legata alla inclusione di istologico
Nelle analisi di diversi parametri morfologici quantitativi misurati nelle sezioni istologiche del tessuto, l’effetto di restringimento di incorporamento-relative del tessuto che si verificano durante la lavorazione per l’istologia del tessuto deve essere determinato e presi in considerazione. L’entità del restringimento di incorporamento-relative del tessuto può essere variabile e dipende sia il tessuto, l’elaborazione e l’incasso medio^{8,13,17,18,19}. Generalmente, cambiamenti relativi all’incorporamento del volume di un campione di tessuto (cioè, per lo più restringimento) si verificano in tutte le tre dimensioni dello spazio e, di conseguenza, influisce su tutti i parametri dimensionali stimati dalle analisi stereologiche quantitative⁸ . In sostanza, il grado di restringimento di incorporamento-relative del tessuto, espresso come il fattore di ritiro lineare tessuto (f_S), può essere stimato come indicato al punto 1.3. e usate per la correzione di parametri morfologici quantitativi (restringimento sensibile)¹⁴.

Campionamento casuale sistematico-ponderato sul volume di organi/tessuti
Istituzione di una raccolta di Biobanca di campioni dell’organo/tessuto suino, approcci sistematici di campionamento casuale-ponderato sul volume come descritti nel passaggio 2 hanno dimostrato di essere pratiche, risparmio di tempo ed efficienti tecniche per la generazione del rappresentante, tessuto multi-purpose campioni^7,8,9,15.

Generazione di sezioni isotropica uniforme casuale e casuale uniforme verticale per analisi quantitative stereologiche
Biobanca di campioni di tessuto devono essere adatto per una vasta gamma di metodi differenti di analisi stereologiche quantitativa per la stima di un massimo di parametri che non potrebbe essere determinato senza un esemplare adeguatamente preparato. Quasi tutti i parametri quantitativi stereologiche possono essere determinati, utilizzando “isotropo (indipendente) casuale (IUR) sezioni uniformi”^8,9. Nelle sezioni IUR, l’orientamento tridimensionale del piano di sezione del campione di tessuto è casuale. Ciò può essere ottenuto dalla randomizzazione della posizione del campione di tessuto rispetto alla posizione del piano di sezione, come applicato nei “Isector” metodo¹¹ (punto 3.1 del protocollo), o da casualizzazione dell’orientamento del piano di sezione relativi alla campione di tessuto, come il metodo di “Orientatore”¹⁰ (passo 3.2 del protocollo). Nei campioni di tessuto, come la pelle o la mucosa esemplare Mostra un asse verticale naturalmente presente, o definito e correttamente identificabile, preparazione di “verticale uniforme casuale (RVU) sezioni” (fase di protocollo 3.3.) sezionato rigorosamente all’interno del piano di loro asse verticale è vantaggioso^8,20. Per un discorso completo dei fondamenti teorici del campionamento IUR/VUR e una discussione esaustiva delle potenziali a valle analisi quantitativi stereologiche, si rimanda il lettore interessato ai libri di testo di stereology quantitativa nella vita Scienze^8,9.

Protocol

Tutti i metodi descritti qui utilizzano campioni di tessuto derivati da animali morti e rispondono pienamente le norme di legge tedesche del benessere degli animali. 1. volumetria Tecnica di immersione per la determinazione della densità di tessuto/organo (Figura 1 e Figura 2) 7 , 12 , <sup class="xref"…

Representative Results

Tecnica di immersione per la determinazione della densità di tessuto/organo Figura 12A -B Mostra il rappresentanza determinazione della densità e il volume di un rene porcino usando la tecnica di immersione descritta nel passaggio 1.1 (Figura 1, Figura 2). Risultati più rappresentativi delle misurazioni di densità di suini…

Discussion

Generazione di biobanca campionari da modelli animali suine richiede tecniche robuste ed i protocolli per la determinazione dei volumi di organi/tessuti, la generazione riproducibile del rappresentante, campioni di tessuto ridondante adatti per una vasta gamma di metodi di analisi diversi e per la randomizzazione dell’orientamento delle sezioni del campione per analisi stereologiche quantitative. I metodi descritti nel presente articolo sono adattati alle dimensioni dei suini organi e tessuti e sono stati sviluppati per …

Materials

Agar	Carl Roth GmbH, Germany	Agar (powder), Cat.: 5210.3	Dissolve approximately 1 g of agar in 10 ml cold water in a glass or plastic beaker, heat in microwave-oven at 700 W, boil the solution twice with rigorous stirring. Cast into mold while still warm and let solidify. Caution: While handling with hot liquid agar, wear protective goggles and gloves.
Caliper	Hornbach Baumarkt GmbH, Bornheim, Germany	Schieblehre Chrom/Vernickelt 120 mm Cat.: 3664902	Any kind of caliper (mechanical or electronic) will do as well.
Casting molds (metal)	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	Einbettschälchen aus Edelstahl, 14 x 24 x 5 mm, Cat.: 14302b	Any other kind of metal casting mold used for paraffin-embedding will do as well.
Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm)	n.a.	n.a.	Copy templates of cross grids (5mm – 6 cm) are provided in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016)
Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles	n.a.	n.a.	Copy templates of equiangular and cosine-weighted circles are provided in Nyengaard & Gundersen. Eur Respir Rev. 15, 107-114, doi: 10.1183/09059180.00010101 (2006) and in Gundersen et al. Stereological Principles and Sampling Procedures for Toxicologic Pathologists. In: Haschek and Rousseaux´s Handbook of Toxicologic Pathology. 3rd ed, 215-286, ISBN: 9780124157590 (2013).
Foldback clamps (YIHAI binder clips, 15 mm and 19 mm)	Ningbo Tianhong Stationery Co ltd., China	Y10006 and Y10005	Any other type of standard office foldback clamps will do as well.
Forceps (anatomical)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	neoLab Standard -Pinzette 130 mm, anatomisch, rund, Cat.: 1-1811	Any type of anatomical forceps will do.
Formaldehyde-solution 4%	SAV-Liquid Produktion GmbH, Flintsbach, Germany	Formaldehyd 37/40 %, Cat.: 1000411525005	Dilute to 4% from concentrated solution. Buffer to neutral pH. Wear appropriate eye-, hand- and respiratory protection. Process tissue samples fixed in formaldehyde solution under an exhaust hood and wear protective goggles and laboratory gloves.
Graph paper (for calibration)	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Penig Millimeterpapier A4, Cat.: 2514	Any type of graph paper (scaled in millimeter) will do.
Laboratory beakers (5ml, 10 ml, 50 ml, 100 ml)	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Becherglas SIMAX® , niedrige Form, Borosilikatglas 3.3 Cat.: E-1031, E-1032, E-1035, E-1036	Any kind of glass- or plastic beakers of 5 – 100 ml volume will do.
Laboratory scale(s)	Mettler Toledo GmbH, Gießen, Germany	PM6000	Any standard laboratory scales with measuring ranges between 0.1 mg to approximately 20 g, respectively between 100 mg to approximately 500 g will do
	Sartorius AG, Göttingen, Germany	BP61S
Microtome blades	Engelbrecht Medizin & Labortechnik, Edermünde, Germany	FEATHER Microtome blasdes S35, Cat.:14700	Any kind of single-use microtome blades will do.
Morphometry/planimetry software/system	National Institute of Health (NIH)	ImageJ	Download from https://www. imagej.nih.gov/ij/ (1997).
	Zeiss-Kontron, Eching, Germany	VideoplanTM image analysis system	Out of stock
Photo camera	Nikon	D40	Any kind of digital photocamera that can be mounted to a tripod  will do.
Plastic transparencies	Avery Zweckform GmbH, Oberlaindern, Germany	Laser Overhead-Folie DINA4 Cat.:  3562	Any (laser)-printable plastic transparency will do.
Random number tables	n.a.	n.a.	Random number tables can conveniently be generated (with defined numbers of random numbers and within defined intervals), using random number generators, such as: https://www.random.org/
Razor blades	Plano GmbH, Wetzlar, Germany	T5016	Any kind of razor blades will do.
Ruler	Büromarkt Böttcher AG, Jena, Germany. www.bueromarkt-ag.de	Office-Point Lineal 30 cm, Kunststoff, transparent, Cat.: ln30	Any kind of cm-mm-scaled ruler will do as well.
Saline (0.9%)	Carl Roth GmbH, Germany	Natriumchlorid, >99% Cat.: 0601.1	To prepare 0.9% saline, dissolve 9 g NaCl in 1000 ml of distilled water at 20°C.
Scalpel blades	Aesculap AG & Co KG, Tuttlingen, Germany	BRAUN Surgical blades N°22	Any kind of scalpel blades will do.
Scanner	Hewlett-Packard	hp scanjet 7400c	Any type of standard office scanner capable of scanning with resolutions from 150-600 dpi will do.
Slicing devices	n.a.	n.a.	Examples forself constructed slicing devices can be found in Knust, et al. Anatomical record. 292, 113-122, doi: 10.1002/ar.20747 (2009) and in the supplemental data file of Albl et al.  Toxicol Pathol. 44, 414-420, doi: 10.1177/0192623316631023 (2016).
Spherical casting molds (e.g., in 25.5 mm diameter)	Pralinen-Zutaten.de, Windach, Germany	Pralinen-Hohlkugeln Vollmilch, 25.5 mm	Spherical casting molds can as well be be self-constructed, or obtained from other confectioner suppliers (for for pralines). The casting molds indicated here are actually the package/wrapping of hollow pralines bodies (first eat the pralines and then use the package for generation of i-sector sections)
Thin wire	Basteln & Hobby Schobes, Straßfurth, Germany. www,bastel-welt.de	Messingdraht (0.3 mm) Cat.: 216464742	Any other kind of thin wire will also do.
Tissue paper	NeoLab Migge GmbH, Heidelberg, Germany	Declcate Task Wipes-White, Cat.: 1-5305	Any other kind of laboratory tissue paper will do as well.
Waterproof pen	Staedler Mars GmbH & Co KG, Nürnberg, Grmany	Lumocolor permanent 313, 0.4 mm, S, black, Cat.: 313-2	Any other kind of waterproof pen will do as well.