Mouvements de tissu endocardique suivant via Photoconversion de cellules dans l’embryon de poisson zèbre
Summary
Ce protocole décrit une méthode pour la photoconversion de la protéine fluorescente de Kaede dans les cellules du vivant endocardiques embryon de poisson zèbre qui permet le suivi des cellules endocardiaques pendant le canal atrio-ventriculaire et le développement de valve auriculo-ventriculaire cardiaque .
Abstract
Au cours de l’embryogenèse, les cellules subissent des changements dynamiques dans le comportement de la cellule, et déchiffrer la logique cellulaire sous-jacente de ces changements est des objectifs fondamentaux dans le domaine de la biologie du développement. La découverte et le développement de protéines et ont aidé considérablement notre compréhension de ces changements dynamiques en fournissant une méthode pour surligner optiquement les cellules et les tissus. Cependant, tandis que photoconversion, Time-lapse microscopie et analyse d’images ultérieures sont révélés très efficaces dans la découverte dynamique cellulaire dans des organes comme le cerveau ou le œil, cette approche est généralement pas utilisée en plein développement dû à défis posés par le mouvement rapide du cœur au cours du cycle cardiaque. Ce protocole se compose de deux parties. La première partie décrit une méthode pour photoconverting et par la suite suivi les cellules endocardiques (CPSE) pendant zebrafish canal atrio-ventriculaire (AVC) et le développement de valve auriculo-ventriculaire cardiaque. La méthode implique temporairement arrêter le cœur avec un médicament sous ordonnance pour photoconversion précise avoir lieu. Cœurs sont autorisés à reprendre le passage à tabac lors du retrait de la drogue et le développement de l’embryon continue normalement jusqu’à ce que le cœur est arrêté à nouveau pour l’imagerie haute résolution de photoconverted CDE à un moment du développement plus tard. La deuxième partie du protocole décrit une méthode d’analyse permettant de quantifier la longueur d’une région photoconverted ou non-photoconverted dans l’AVC chez les jeunes embryons en mappant le signal fluorescent de la structure en trois dimensions sur un plan bidimensionnel en image . Ensemble, les deux parties du protocole permet d’examiner l’origine et le comportement de cellules qui composent le poisson-zèbre AVC et la valvule auriculo-ventriculaire et peut potentiellement s’appliquer pour l’étude de mutants, morphants ou embryons qui ont été traités avec réactifs qui perturbent le développement AVC et/ou vanne.
Introduction
Le poisson-zèbre est actuellement un des modèles de vertébrés plus importants pour étudier les processus cellulaires et développement in vivo. C’est en grande partie en raison de la transparence optique du poisson-zèbre et susceptibilité génétique, qui en fait un modèle puissant pour l’application de techniques optiques impliquant génétiquement encodé photopériode protein technologies1. Spécifique à l’étude du développement du cœur, zebrafish reçoivent suffisamment d’oxygène par l’intermédiaire de diffusion tels que des mutants même sans battement de coeur peuvent survivre grâce à la première semaine de développement, permettant des analyses sur les effets des gènes du développement et perturbé circulation sanguine sur la morphogenèse du cœur n’est pas possible dans la plupart vertébrés2.
Le tube de coeur de poisson-zèbre est formé de 24 heures après la fécondation (hpf). Peu de temps après sa formation, le tube de coeur commence à battre activement. Par 36 hpf, une constriction claire sépare l’oreillette du ventricule. Cette région de constriction est appelée le canal atrio-ventriculaire (AVC) et les cellules dans ce changement de région d’une morphologie squameuse à une morphologie cubique3. Zebrafish commence de morphogenèse valve atrioventriculaire environ 48 h après la fécondation. Après 5 jours après la fécondation, deux feuillets de la valve s’étendent dans l’AVC et empêchent le reflux du sang du ventricule vers l’oreillette pendant le cycle cardiaque4. Cellules de suivi durant la formation AVC et vanne est difficile comme le battement rapid du cœur, il est difficile de suivre les cellules par l’intermédiaire de la microscopie traditionnelle Time-lapse5,6. Ce protocole, adapté de Steed et coll., 20167, décrit une méthode qui utilise la lignée transgénique de poisson zèbre8 du Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede), dans lequel la protéine et Kaede est exprimée en cellules endothéliales, y compris l’endocarde. Le médicament 2, 3-butanedione-2-monoxime (BDM) est utilisée pour arrêter temporairement le cœur battant, ce qui permet de photoconversion précise de la REE entre 36 et 55 hpf et l’imagerie à haute résolution des photoconverted CDE à des points spécifiques du développement. Auparavant, il a été démontré que les REE photoconverted à l’aide de cette méthode peut rester distingue de leurs voisins non convertis pendant cinq jours ou plus après l’heure de photoconversion7. Ce protocole décrit également une méthode utilisée pour l’analyse d’images de photoconverted perturbateurs endocriniens chez les embryons âgés de moins de 48 hpf, qui a été utilisé avec succès pour suivre les mouvements du tissu pendant AVC développement (Boselli et coll., sous presse)9. Nous espérons que les lecteurs trouveraient ce protocole utile pour étudier le développement AVC et vanne en embryons normaux et des mutants, morphants ou embryons traités. Pour un protocole plus général relatives au suivi de cellule à l’aide de protéines et au cours du développement du poisson zèbre, veuillez consulter l’article par Lombardo et al., 201210.
Protocol
Representative Results
Discussion
Calendrier des photoconversion: bien que Kaede reste brillamment exprimé en CDE même à 96 hpf, il convient de noter que que l’embryon se développe, la lumière laser diffuse plus avant qu’elle atteigne l’AVC, complique davantage la photoconversion clos de Kaede. Met en scène plus tard que 55 at embryonnaire hpf, la montgolfière le ventricule et l’oreillette signifie aussi que le faisceau laser violet utilisé pour photoconversion ne peut pas atteindre les cellules AVC sans la première traversée d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous tenons à remercier Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli et Basile Gurchenkov pour aider à concevoir et fabriquer le moule décrit dans le présent protocole. Ce travail a été soutenu par l’ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), le EMBO Young Investigator programme, FRM (DEQ20140329553), la Communauté européenne, ERC CoG N ° 682938 Evalve et par la grant ANR-10-LABX-0030-INRT, un fonds de l’État français géré par l’Agence Nationale de la Recherche dans le cadre programme Investissements d’avenir marqué ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
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