Följande endokardiella vävnad rörelser via Cell Photoconversion i zebrafiskar embryot
Summary
Det här protokollet beskriver en metod för photoconversion av Kaede fluorescerande protein i endokardiella celler levande zebrafiskar embryo som möjliggör spårning av endokardiella celler under atrioventrikulär kanal och atrioventrikulärt hjärtat ventil utveckling .
Abstract
Under embryogenes, celler genomgår dynamiska förändringar i cell beteende och dechiffrera cellulära logiken bakom dessa förändringar är ett grundläggande mål i fältet i utvecklingsbiologi. Upptäckten och utvecklingen av photoconvertible proteiner har kraftigt hjälpt vår förståelse av dessa dynamiska förändringar genom att tillhandahålla en metod för att optiskt markera celler och vävnader. Dock även photoconversion, time-lapse mikroskopi och efterföljande bildanalys har visat sig vara mycket framgångsrik i avslöjande cellulära dynamik i organ såsom hjärnan eller ögat, används detta tillvägagångssätt inte i allmänhet i utvecklingsländer hjärtat beror på utmaningar som den snabba rörelsen av hjärtat under hjärt cykeln. Detta protokoll består av två delar. Den första delen beskriver en metod för photoconverting och därefter spårning endokardiella celler (hormonstörande ämnen) under zebrafiskar atrioventrikulär kanal (AVC) och atrioventrikulärt hjärtat ventil utveckling. Metoden innebär att temporally stoppa hjärtat med en drog för korrekt photoconversion att äga rum. Hjärtan är tillåtna att återuppta stryk vid avlägsnande av drogen och embryonal utveckling fortsätter normalt tills hjärtat stoppas igen för högupplöst avbildning av photoconverted hormonstörande ämnen vid en senare tidpunkt utvecklingstoxicitet. Den andra delen av protokollet beskriver en bild analysmetod för att mäta längden på en photoconverted eller icke-photoconverted region i AVC i unga embryon genom att mappa fluorescerande signalen från den tredimensionella strukturen på en tvådimensionell karta . Tillsammans, de två delarna av protokollen som gör att man kan undersöka ursprung och beteende av celler som utgör zebrafiskar AVC och atrioventrikulärt hjärtklaff och potentiellt kan användas för att studera mutanter, morphants eller embryon som har behandlats med reagenser som stör AVC och/eller ventilen utveckling.
Introduction
Zebrafiskar är för närvarande en av de viktigaste ryggradsdjur modellerna att studera cellulära och utvecklande processer i vivo. Detta beror till stor del den zebrafiskar optisk transparens och föredragandens till genetik, vilket gör det en kraftfull modell för att tillämpa optiska tekniker som innefattar genetiskt kodade photoresponsive protein teknik1. Specifika för studiet av hjärtat utveckling, zebrafiskar får tillräckligt med syre via diffusion sådan att även mutanter utan hjärtslag kan överleva genom den första veckan av utveckling, tillåter analyser på effekterna av utvecklingstoxicitet gener och perturbed blodflöde på hjärtat morfogenes inte möjligt i de flesta ryggradsdjur2.
Zebrafiskar hjärtat röret bildas av 24 timmar efter befruktning (hpf). Kort efter dess bildande startar hjärtat röret aktivt slog. Av 36 hpf, en tydlig sammandragning separerar atrium från ventrikeln. Denna region av sammandragning kallas atrioventrikulärt kanalen (AVC), och celler i den här regionen förändringen från en skivepitelcancer morfologi till ett kubiskt morfologi3. Zebrafiskar atrioventrikulärt ventil morfogenes inleds runt 48 h lägga befruktning. Med 5 dagar efter befruktning, två ventilen broschyrer sträcker sig in AVC och förhindra tillbaka flödet av blod från kammare till förmak under hjärt cykel4. Spåra celler under AVC och ventil bildandet är utmanande eftersom den snabba hjärtslag gör det svårt att följa celler via traditionella time-lapse mikroskopi5,6. Detta protokoll, anpassad från springare et al., 20167, beskriver en metod som använder Tg (fli1a:gal4FFubs, UAS:kaede)8 zebrafiskar transgena raden, där det photoconvertible proteinet Kaede är uttryckt i endotelceller, inklusive endocardium. Den drog 2,3-butandion-2-monoxime (BDM) används för att tillfälligt stoppa hjärtat slå, så att korrekt photoconversion av hormonstörande ämnen mellan 36 och 55 hpf och högupplöst avbildning av photoconverted hormonstörande ämnen vid särskilda utvecklingsmässiga tidpunkter. Det har tidigare visat att hormonstörande ämnen photoconverted med den här metoden kan förbli skiljas från sina oomvända grannar för fem dagar eller mer efter tidpunkten för photoconversion7. Detta protokoll också detaljerna en metod som används för bildanalys av photoconverted hormonstörande ämnen i embryon yngre än 48 hpf, som framgångsrikt har använts för att följa vävnad rörelser under AVC utveckling (Boselli et al., i pressen)9. Vi hoppas att läsarna skulle finna detta protokoll användbar för att studera AVC och ventil utveckling i normala embryon, och mutanter, morphants eller drog-behandlade embryon. För en mer allmän protokollet till cell tracking med hjälp av photoconvertible proteiner under zebrafiskar utveckling, vänligen se artikeln av Lombardo et al., 201210.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidpunkten för photoconversion: även om Kaede är fortfarande ljust uttryckt i hormonstörande ämnen även vid 96 hpf, det bör noteras att när embryot växer, laserljus sprider mer innan det når AVC, försvårar trånga photoconversion av Kaede. At embryonala stadier senare än 55 hpf, ballooning av ventrikeln och atrium innebär också att Violetta laserstrålen används för photoconversion inte kan nå AVC celler utan första passerar genom antingen atrium eller ventrikeln. Detta innebär att utöver 55…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Anne-Laure Duchemin, Denise Duchemin, Nathalie Faggianelli och Basile Gurchenkov för att hjälpa till att designa och tillverka den mögel som beskrivs i detta protokoll. Detta arbete stöds av FRM (DEQ20140329553), ANR (ANR-15-CE13-0015-01, ANR-12-ISV2-0001-01), EMBO Young Investigator programmet, gemenskapens ERC CoG N ° 682938 Evalve och av bidraget ANR-10-LABX-0030-INRT, en franska statens fond förvaltas av den Agence Nationale de la Recherche under den ram program Investissements pris märkt ANR-10-IDEX-0002-02.
Materials
| Materials | |||
| Necessary equipment for raising fish and collecting eggs (see the Zebrafish Book22 for details). | |||
| Stereomicroscope | |||
| Upright confocal microscope (Equipped with lasers operating at 488 nm, 561 nm, and 405 nm, a tunable multiphoton laser, and a Leica HCX IRAPO L, 25 ×, N.A. 0.95 objective) | Leica | Leica SP8 | |
| Heat block | ThermoScientific | 88870001 | |
| 35 mm x 10 mm tissue culture dish | Falcon | 353001 | |
| 6 well plate | Falcon | 353046 | |
| Petri dish | |||
| Forceps | |||
| Glass pipette | |||
| Mold | |||
| Reagents | |||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| UltraPure low melting point agarose | Invitrogen | 16520-050 | |
| Agarose | Lonza | 50004 | |
| PTU (1-phenyl-2-thiourea) | Sigma Aldrich | P7629 | |
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| Software | |||
| Matlab equipped with the Image Analysis, Curve Fitting, Bio-Formats Toolboxes | MathWorks | ||
| 8 mg/mL Tricaine stock solution | |||
| 200 mg of tricaine powder (Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | E10521 | |
| 25 mL Danieau | |||
| Adjust to pH 7, aliquot and store at -20 °C | |||
| 1 M BDM stock solution | |||
| 1 g BDM | Sigma-Aldrich | 112135 | |
| 10 mL ddH2O | |||
| Aliquot and store at -20 °C | |||
| Embryo medium: 30x stock solution | |||
| 50.7 g NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | |
| 0.78 g KCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
| 1.47 g Magnesium sulfate | Sigma-Aldrich | 7487-88-9 | |
| 2.1 g Calcium nitrite tetrahydrate | Sigma-Aldrich | 13477-34-4 | |
| 19.52 g HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid) | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| Adjust to pH 7.2 and store at room temperature | |||
| Mold | |||
| PlasCLEAR resin | Asiga | ||
| Plus 39 Freeform Pico 3D printer | Asiga |
References
- Chow, R. W., Vermot, J. The rise of photoresponsive protein technologies applications in vivo: a spotlight on zebrafish developmental and cell biology. F1000Res. 6, (2017).
- Sehnert, A. J. Cardiac troponin T is essential in sarcomere assembly and cardiac contractility. Nat Genet. 31, 106-110 (2002).
- Peal, D. S., Lynch, S. N., Milan, D. J. Patterning and development of the atrioventricular canal in zebrafish. J Cardiovasc Transl Res. 4, 720-726 (2011).
- Boselli, F., Freund, J. B., Vermot, J. Blood flow mechanics in cardiovascular development. Cell Mol Life Sci. 72 (13), 2545-2559 (2015).
- Steed, E., Boselli, F., Vermot, J. Hemodynamics driven cardiac valve morphogenesis. Biochim Biophys Acta. , (2015).
- Boselli, F., Vermot, J. Live imaging and modeling for shear stress quantification in the embryonic zebrafish heart. Methods. , (2015).
- Steed, E. klf2a couples mechanotransduction and zebrafish valve morphogenesis through fibronectin synthesis. Nat Commun. 7, 11646 (2016).
- Herwig, L. Distinct cellular mechanisms of blood vessel fusion in the zebrafish embryo. Curr Biol. 21 (22), 1942-1948 (2011).
- Boselli, F., Steed, E., Freund, J., Vermot, J. Anisotropic shear stress patterns predict the orientation of convergent tissue movements in the embryonic heart. Development. , (2017).
- Lombardo, V. A., Sporbert, A., Abdelilah-Seyfried, S. Cell Tracking Using Photoconvertible Proteins During Zebrafish Development. J. Vis. Exp. (67), (2012).
- JoVE Science Education Database. . Biology II: Mouse, Zebrafish, and Chick. Zebrafish Breeding and Embryo Handling. , (2017).
- Watanabe, Y. Inhibitory effect of 2,3-butanedione monoxime (BDM) on Na(+)/Ca(2+) exchange current in guinea-pig cardiac ventricular myocytes. Br J Pharmacol. 132 (6), 1317-1325 (2001).
- Jou, C. J., Spitzer, K. W., Tristani-Firouzi, M. Blebbistatin effectively uncouples the excitation-contraction process in zebrafish embryonic heart. Cell Physiol Biochem. 25 (4-5), 419-424 (2010).
- Pestel, J. Real-time 3D visualization of cellular rearrangements during cardiac valve formation. Development. 143 (12), 2217-2227 (2016).
- Swinburne, I. A., Mosaliganti, K. R., Green, A. A., Megason, S. G. Improved Long-Term Imaging of Embryos with Genetically Encoded alpha-Bungarotoxin. PLoS One. 10 (8), e0134005 (2015).
- Kaufmann, A., Mickoleit, M., Weber, M., Huisken, J. Multilayer mounting enables long-term imaging of zebrafish development in a light sheet microscope. Development. 139 (17), 3242-3247 (2012).
- Marchant, J. S., Stutzmann, G. E., Leissring, M. A., LaFerla, F. M., Parker, I. Multiphoton-evoked color change of DsRed as an optical highlighter for cellular and subcellular labeling. Nat Biotechnol. 19 (7), 645-649 (2001).
- Dempsey, W. P. In vivo single-cell labeling by confined primed conversion. Nat Methods. 12 (7), 645-648 (2015).
- Mohr, M. A., Pantazis, P. Single neuron morphology in vivo with confined primed conversion. Methods Cell Biol. 133, 125-138 (2016).
- Mohr, M. A., Argast, P., Pantazis, P. Labeling cellular structures in vivo using confined primed conversion of photoconvertible fluorescent proteins. Nat Protoc. 11 (12), 2419-2431 (2016).
- Mohr, M. A. Rational Engineering of Photoconvertible Fluorescent Proteins for Dual-Color Fluorescence Nanoscopy Enabled by a Triplet-State Mechanism of Primed Conversion. Angew Chem Int Ed Engl. 56 (38), 11628-11633 (2017).
- Dempsey, W. P., Fraser, S. E., Pantazis, P. PhOTO zebrafish: a transgenic resource for in vivo lineage tracing during development and regeneration. PLoS One. 7 (3), e32888 (2012).
- Dempsey, W. P., Qin, H., Pantazis, P. In vivo cell tracking using PhOTO zebrafish. Methods Mol Biol. 1148, 217-228 (2014).
