एक Endothelial सेल मनका अंकुरण परख में Pericytes शामिल
Summary
इस प्रोटोकॉल इन विट्रो मनका परख में एक उपंयास प्रस्तुत करता है कि अधिक उचित मॉडल pericytes को शामिल करके vivo अंकुरण angiogenesis में की प्रक्रिया । इस संशोधन मनका परख सक्षम बनाता है और अधिक ईमानदारी endothelial कोशिकाओं और भित्ति कोशिकाओं है कि angiogenesis के लिए महत्वपूर्ण है के बीच heterotypic सेलुलर बातचीत दोहराऊंगा ।
Abstract
Angiogenesis पूर्व मौजूदा vasculature से नए जहाजों की वृद्धि है और embryogenesis और विकास, घाव भरने, ट्यूमर के विकास और मेटास्टेसिस, और नेत्र और हृदय रोगों सहित कई जैविक प्रक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण घटक है । इन विट्रो मॉडल है कि दोहराऊंगा angiogenesis के जीव विज्ञान के लिए उचित इस प्रक्रिया का अध्ययन और विनियमन है कि अंततः उपंयास चिकित्सीय रणनीतियों के लिए लक्षित किया जा सकता है के तंत्र की पहचान की जरूरत है । मनका angiogenesis परख पहले किया गया है दोहराऊंगा में endothelial अंकुरण के कई चरणों का प्रदर्शन इन विट्रो । हालांकि, इस परख की एक सीमा endothelial की कमी है-भित्ति कोशिका बातचीत, जो vivo मेंendothelial सेल समारोह के आणविक और phenotypic विनियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं । यहां दिए गए प्रोटोकॉल मनका angiogenesis परख में भित्ति कोशिकाओं के शामिल करने के लिए एक पद्धति प्रस्तुत करता है और endothelial कोशिकाओं और pericytes के एक तंग सहयोग इन विट्रो मेंअंकुरण के दौरान दर्शाता है । प्रोटोकॉल भी यंत्रवत अध्ययन के लिए endothelial कोशिकाओं में सिरना का उपयोग कर लक्ष्य जीन के प्रभावी मुंह बंद करने के लिए एक पद्धति का ब्यौरा । कुल मिलाकर, इस प्रोटोकॉल एक इन विट्रो परख है कि अधिक उचित मॉडल विविध कोशिका अंकुरण angiogenesis में शामिल प्रकार प्रदान करता है, और एक और अधिक शारीरिक-चिकित्सीय मूल्यांकन और उपंयास की खोज के लिए प्रासंगिक मंच प्रदान करता है angiogenesis विनियमन के तंत्र ।
Introduction
Angiogenesis उचित embryogenesis और घाव भरने के लिए महत्वपूर्ण है, और यह भी कैंसर प्रगति1 और कोरोनरी धमनी रोग सहित कई रोगों में महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । 2 , 3 कैसे angiogenesis सामांय विकास के दौरान होता है की एक बेहतर समझ होने, और कैसे यह रोग संदर्भों में पुनः सक्रिय है, उपंयास के विकास के लिए महत्वपूर्ण है, प्रभावी चिकित्सकीय । इन विट्रो मॉडल कि दोहराऊंगा महत्वपूर्ण चरणों और सेल vivo में angiogenesis में शामिल प्रकार के शोधकर्ताओं की अनुमति के लिए बेहतर आणविक angiogenesis ड्राइविंग तंत्र की विशेषताएं और उपंयास खोजों की जरूरत है राज्यात endothelial नियमन.
Nakatsu और ह्यूजेस एक अंकुरित मनका परख कि वे angiogenesis अंकुरण के कई ज्ञात चरणों का प्रदर्शन किया है अनुकूलित है । 4 , 5 यहां प्रस्तुत विधि का उद्देश्य परख में perictyes शामिल करके Nakatsu और ह्यूजेस द्वारा अनुकूलित परख पर बनाने के लिए है, ताकि endothelial कोशिका अंकुरण में भित्ति कोशिकाओं के paracrine और juxtracrine भूमिकाओं में शामिल किया जा सकता है कादंबरी angiogenesis. Pericytes भित्ति कोशिकाओं है कि कोशिकाओं है कि उनके कारण endothelial कोशिकाओं के साथ बंद शारीरिक संपर्क बनाए रखने के रूप में उनकी भूमिका द्वारा परिभाषित कर रहे है संवहनी तहखाने झिल्ली में एंबेडेड रहे हैं । 6 Pericytes और endothelial कोशिकाएं पायदान संकेतन, आंग-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ, और कई अन्य सहित सिग्नलिंग मार्ग के माध्यम से जटिल क्रॉस-टॉक में संलग्न हैं । 7 , इन संकेतन रास्ते में कमी 8 माउस मॉडल embryogenesis में vasculature के विकास के गरीब pericyte कवरेज का प्रदर्शन, गरीब संवहनी remodeling और बेकार vasculature के लिए अग्रणी. 7 इसके अलावा, रोग angiogenesis में pericytes की भूमिका महत्वपूर्ण है, लेकिन अक्सर के तहत की सराहना की । उदाहरण के लिए, ट्यूमर vasculature की एक अनूठी विशेषता यह है कि जहाजों अधिक अपरिपक्व हैं, टपका हुआ, और गरीब pericyte कवरेज के कारण बेकार. 9 यह प्रस्ताव किया गया है कि उपस्थिति या pericytes की अनुपस्थिति नाटकीय रूप से ट्यूमर रक्त वाहिकाओं के phenotype प्रभावों और antiangiogenic और अर्बुदरोधी चिकित्सा के लिए प्रतिक्रियाओं का एक महत्वपूर्ण मध्यस्थ है. 9 इस प्रकार, इन विट्रो परख में pericytes की भूमिका सहित और अधिक पूरी तरह से endothelial विनियमन के महत्वपूर्ण तंत्र पर कब्जा करने के लिए महत्वपूर्ण है ।
हालांकि वहां कई विट्रो और पूर्व vivo वर्तमान में angiogenesis अध्ययन करने के लिए कार्यरत परख रहे हैं, वहां कमियों को प्रत्येक में विचार कर रहे हैं । कुछ, जैसे endothelial प्रसार और endothelial प्रवास परख, पीढ़ी सरलीकृत कर रहे है और ऊतक संस्कृति प्लास्टिक पर एक अलग सेटिंग में एक endothelial समारोह पर ध्यान केंद्रित । 10 अंय परख एक और 3 आयामी (3 डी) की स्थापना, ऐसे Matrigel ट्यूब गठन की परख,10 लेकिन इन परख अभी भी अधिक है और endothelial कोशिकाओं की क्षमता पर अधिक ध्यान केंद्रित करने के लिए और प्रवास के रूप में होते है de नोवो संवहन संरचनाओं, के रूप में पूर्व से अंकुरित मौजूदा vasculature का विरोध किया । इसके अलावा, इन परख के कोई भी भित्ति कोशिका प्रकार को शामिल । ऐसे अंगूठी महाधमनी परख कि मेजबान अंग में मौजूद pericytes शामिल कर के रूप में पूर्व vivo मॉडल हैं, लेकिन इन मॉडलों के आनुवंशिक हेरफेर अधिक नॉकआउट या ट्रांसजेनिक माउस मॉडल पैदा करने की आवश्यकता के कारण चुनौतीपूर्ण है ब्याज के रास्ते । मनका अंकुरण परख क्योंकि यह मॉडल अंकुरण endothelial, प्रसार, प्रवास, और यहां तक कि एक 3 डी मैट्रिक्स में सम्मिलन और लुमेन गठन आदर्श है । 4 परख श्रद्धालुओं अंकुरण के कई विभिंन चरणों के यंत्रवत आकलन के लिए अनुमति देता है, जबकि अभी भी या तो endothelial कोशिकाओं या pericytes के प्रत्यक्ष आनुवंशिक संशोधन के लिए एक अधिक नियंत्रित सेटिंग में की अनुमति । अंकुरित मोतियों से युक्त फाइब्रिन थक्के आसानी से तय किए जा सकते हैं, दाग, और अंकुरण के विभिन्न चरणों में imaged; ये अंकुरित अंकुरण के रीयल-टाइम इमेजिंग को करने के लिए एक लाइव इमेजिंग चैंबर में भी रखा जा सकता है । पद्धति यहां प्रस्तुत की गहराई phenotyping और angiogenesis के दौरान सक्रिय रास्ते का गहन विश्लेषण के माध्यम से angiogenesis के बुनियादी तंत्र का अध्ययन करने के लिए आदर्श है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल निस्र्पक के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है जटिल चरणों और अंकुरण angiogenesis के heterotypic सेलुलर बातचीत शोधकर्ता को सक्षम करने के लिए आनुवंशिक और इमेजिंग दृष्टिकोण को रोजगार के लिए पूरी तरह से यंत्रवत ज?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम डीआरएस का शुक्रिया अदा करते हैं । विक्टोरिया Bautch और उपयोगी चर्चा और मानक मनका अंकुरित परख शर्तों और एक अंकुरित परख दाग प्रोटोकॉल के अनुकूलन पर सलाह के लिए यहोशू बाउचर । S.H.A. पुरस्कार 5T32 GM007092 के तहत जनरल मेडिकल साइंसेज के राष्ट्रीय संस्थान से एक अनुदान द्वारा भाग में समर्थन किया गया था ।
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
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