Incorporación de pericitos en un grano de célula endotelial brotación ensayo
Summary
Presenta protocolo una novela en vitro la tira de ensayo más modelos adecuadamente el proceso de en vivo brotación angiogénesis mediante la incorporación de pericitos. Esta modificación permite el ensayo de grano más fielmente recapitular las interacciones celulares heterotípicos entre las células endoteliales y las células murales que son críticas para la angiogénesis.
Abstract
Angiogénesis es la formación de nuevos vasos de vasculatura preexistente y es un componente importante de muchos procesos biológicos, incluyendo la embriogénesis y desarrollo, la cicatrización de heridas, crecimiento tumoral y metástasis y enfermedades oculares y cardiovasculares. Se necesitan modelos eficaces en vitro que recapitulan la biología de la angiogénesis adecuadamente este proceso de estudio e identificar mecanismos de regulación que pueden ser objeto en definitiva de nuevas estrategias terapéuticas. El análisis de la angiogénesis de grano ha demostrado previamente para recapitular las etapas múltiples de brotes endoteliales in vitro. Sin embargo, una limitación de este ensayo es una falta de endotelial – interacciones célula mural, que son fundamentales para la regulación molecular y fenotípica de células endoteliales función en vivo. El protocolo aquí presenta una metodología para la incorporación de las células murales en el ensayo de grano angiogénesis y muestra una asociación estrecha de las células endoteliales y pericitos durante brotación in vitro. El protocolo también detalla una metodología eficaz silenciamiento de genes de la blanco usando siRNA en las células endoteliales para estudios mecanísticos. En conjunto, este protocolo proporciona un análisis en vitro que más apropiadamente modelos de los tipos de células distintos implicados en brotes de angiogénesis y proporciona una plataforma más fisiológicamente relevantes para la evaluación terapéutica y nuevo descubrimiento de mecanismos de regulación de la angiogénesis.
Introduction
Angiogénesis es vital para la embriogénesis apropiado y la cicatrización de heridas, y también desempeña papeles claves en numerosas enfermedades incluyendo cáncer progresión1 y la arteria coronaria de la enfermedad. 2 , 3 tener una mejor comprensión de cómo se produce la angiogénesis en el desarrollo normal, y cómo se reactiva en contextos patológicos, es fundamental para el desarrollo de la novela, la terapéutica eficaz. Modelos fieles en vitro que recapitulan las etapas importantes y tipos de células implicados en la angiogénesis en vivo son necesarios para permitir que los investigadores mejor caracterizar los mecanismos moleculares conduce angiogénesis y hacer nuevos descubrimientos en la regulación endotelial.
Nakatsu y Hughes han optimizado un ensayo de grano brotes que han demostrado sufre el conocido muchas etapas de brotación angiogénesis. 4 , 5 el propósito del método presentado aquí es aprovechar el análisis optimizado por Nakatsu y Hughes con la incorporación de perictyes en el ensayo, para que las funciones paracrinas y juxtracrine de mural células en células endoteliales brotación pueden ser incorporadas en estudios de novela de la angiogénesis. Pericitos son células murales que se definen por su función como células que mantienen contacto físico con las células endoteliales debido a ser incrustados en la membrana basal vascular. 6 células endoteliales y pericitos participan en complejo la diafonía mediante vías incluyendo muesca de señalización señalización, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ y muchos otros. 7 , 8 modelos de ratón deficientes en estas vías de señalización demuestran pericyte pobre cobertura del desarrollo de la vasculatura en la embriogénesis, conduce a la remodelación vascular pobre y disfuncional vasculatura. 7 además, el papel del pericitos en la angiogénesis patológica es importante pero a menudo subestimada. Por ejemplo, una característica única de la vasculatura del tumor es que los vasos son más inmaduros, con fugas y disfuncional debido a la pobre pericyte cobertura. 9 se ha propuesto que la presencia o ausencia del pericitos dramáticamente afecta el fenotipo de los vasos sanguíneos tumorales y es un importante mediador de las respuestas a las terapias antitumorales y antiangiogénicos. 9 así, incluyendo el papel del pericitos en ensayos en vitro es clave captar más completamente los mecanismos importantes de regulación endotelial.
Aunque hay muchos ensayos in vitro y ex vivo actualmente empleados para estudiar la angiogenesis, hay defectos a considerar en cada uno. Algunos, como la proliferación endotelial y ensayos de migración endotelial, son excesivamente simplificados y se centran en una función endotelial en un entorno aislado en cultivo de tejidos de plástico. 10 otros ensayos ocurren en un entorno (3D) tridimensional 3 más, como el ensayo de formación de tubo de Matrigel,10 pero estos ensayos son todavía excesivamente y centran más en la capacidad de las células endoteliales migran y forman de novo vascular estructuras, en lugar de brotar de la vasculatura preexistente. Además, ninguno de estos ensayos incorporan tipos celulares mural. Hay ex vivo la modelos tales como el ensayo de aorta anillo que incorporan pericitos presentes en el órgano anfitrión, pero manipulación genética de estos modelos es mucho más difícil debido a la necesidad de generar modelos transgénicos o knockout del ratón de la rutas de interés. El grano del ensayo de germinación es ideal porque modelos brotación endotelial, proliferación, migración y formación incluso anastomosis y lumen en una matriz 3D. 4 el ensayo fielmente permite evaluación mecanicista de las muchas diferentes etapas de rebrote, permitiendo aún la modificación genética directa del pericitos en un entorno más controlado o de las células endoteliales. Los coágulos de fibrina que contiene los granos brotes pueden fácilmente fijarse, manchados y reflejados en las diferentes etapas de brotación; Estos brotes pueden también colocarse en una cámara de proyección de imagen vivo para realizar la proyección de imagen en tiempo real de las brotaciones. La metodología presentada aquí es ideal para el estudio de mecanismos básicos de la angiogénesis en fenotipado de profundidad y un análisis exhaustivo de las vías que se activan durante la angiogénesis.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo presenta un método para la caracterización de las etapas complejas e interacciones celulares heterotípicos de brotación angiogenesis por lo que permite al investigador a emplear enfoques genéticos y proyección de imagen completa investigaciones mecanicistas. Cuando se realiza el ensayo, es esencial que eficiente recubrimiento endotelial de los granos ocurre durante la cuenta pasos de agitación. Pobre capa endotelial se hará evidente, si los granos no aparecen tienen una superficie áspera de la bol…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a los Drs. Victoria Bautch y Joshua Boucher para discusiones útiles y asesoramiento en la optimización de cuentas estándar brotación las condiciones analíticas y una brotación prueba de protocolo de tinción. S.H.A. fue apoyado en parte por una subvención de la Instituto Nacional de General médica Ciencias bajo concesión de GM007092 de 5T32.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
- Hanahan, D., Folkman, J. Patterns and emerging mechanisms of the angiogenic switch during tumorigenesis. Cell. 86 (3), 353-364 (1996).
- Semenza, G. L. Angiogenesis in ischemic and neoplastic disorders. Annu Rev Med. 54, 17-28 (2003).
- Zhang, Z. G., Chopp, M. Neurorestorative therapies for stroke: underlying mechanisms and translation to the clinic. Lancet Neurol. 8 (5), 491-500 (2009).
- Nakatsu, M. N., Hughes, C. C. An optimized three-dimensional in vitro model for the analysis of angiogenesis. Methods Enzymol. 443, 65-82 (2008).
- Nehls, V., Drenckhahn, D. A novel, microcarrier-based in vitro assay for rapid and reliable quantification of three-dimensional cell migration and angiogenesis. Microvasc Res. 50 (3), 311-322 (1995).
- Sims, D. E. The pericyte–a review. Tissue Cell. 18 (2), 153-174 (1986).
- Armulik, A., Genove, G., Betsholtz, C. Pericytes: developmental, physiological, and pathological perspectives, problems, and promises. Dev Cell. 21 (2), 193-215 (2011).
- Tattersall, I. W., et al. In vitro modeling of endothelial interaction with macrophages and pericytes demonstrates Notch signaling function in the vascular microenvironment. Angiogenesis. 19 (2), 201-215 (2016).
- Jain, R. K. Normalization of tumor vasculature: an emerging concept in antiangiogenic therapy. Science. 307 (5706), 58-62 (2005).
- Tahergorabi, Z., Khazaei, M. A review on angiogenesis and its assays. Iran J Basic Med Sci. 15 (6), 1110-1126 (2012).
- Popson, S. A., et al. Interferon-induced transmembrane protein 1 regulates endothelial lumen formation during angiogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 34 (5), 1011-1019 (2014).
- Coultas, L., Chawengsaksophak, K., Rossant, J. Endothelial cells and VEGF in vascular development. Nature. 438 (7070), 937-945 (2005).
- Newman, A. C., Nakatsu, M. N., Chou, W., Gershon, P. D., Hughes, C. C. The requirement for fibroblasts in angiogenesis: fibroblast-derived matrix proteins are essential for endothelial cell lumen formation. Mol Biol Cell. 22 (20), 3791-3800 (2011).
