Incorporare i periciti un tallone di cellule endoteliali Assay di germogliatura
Summary
Questa presenta protocollo una perlina di romanzo in vitro test che più modelli in modo appropriato il processo di in vivo l’angiogenesi di germogliatura incorporando i periciti. Questa modifica consente il dosaggio di perlina di ricapitolare più fedelmente le interazioni cellulari eterotipiche tra cellule endoteliali e cellule murale che sono critiche per l’angiogenesi.
Abstract
L’angiogenesi è la crescita di nuovi vasi dal sistema vascolare pre-esistente ed è una componente importante di molti processi biologici, compreso l’embriogenesi e sviluppo, guarigione delle ferite, la crescita del tumore e metastasi e malattie oculari e cardiovascolari. Efficace in vitro modelli che ricapitolano la biologia dell’angiogenesi sono necessari per studiare questo processo in modo appropriato e di identificare i meccanismi di regolazione che possono essere in ultima analisi mirate per nuove strategie terapeutiche. L’analisi di angiogenesi della perla è stato dimostrato in precedenza di ricapitolare le fasi multiple di germogliatura endoteliale in vitro. Tuttavia, una limitazione di questo test è una mancanza di endoteliali – interazioni cellula murale, , che sono la chiave per la regolazione molecolare e fenotipica delle cellule endoteliali funzionano in vivo. Il protocollo dato qui presenta una metodologia per l’incorporazione delle cellule murale il dosaggio di angiogenesi perlina e dimostra una stretta associazione delle cellule endoteliali e periciti durante la germinazione in vitro. Il protocollo dettaglia anche una metodologia efficace silenziamento dei geni bersaglio utilizzando siRNA in cellule endoteliali per studi meccanicistici. Complessivamente, questo protocollo fornisce un’analisi in vitro che in modo più appropriato modelli i tipi di cellule diverse coinvolti nell’angiogenesi di germogliatura e fornisce una piattaforma più fisiologicamente rilevanti per la valutazione terapeutica e romanzo scoperta di meccanismi di regolazione dell’angiogenesi.
Introduction
L’angiogenesi è vitale per l’embriogenesi appropriato e la guarigione della ferita, e svolge anche ruoli chiave nelle numerose malattie compreso la malattia dell’arteria coronaria e1 progressione di cancro. 2 , 3 avere una migliore comprensione di come l’angiogenesi si verifica durante lo sviluppo normale, e come esso viene riattivato in contesti patologici, è fondamentale per lo sviluppo del romanzo, terapeutica efficace. Fedele in vitro modelli che ricapitolano le tappe importanti e tipi cellulari coinvolti nell’angiogenesi in vivo sono necessari per permettere ai ricercatori di meglio caratterizzare i meccanismi molecolari che guidano angiogenesi e fare nuove scoperte in regolazione endoteliale.
Nakatsu e Hughes hanno ottimizzato un saggio di perlina germogliatura che hanno dimostrato subisce delle numerose fasi note di germogliatura angiogenesi. 4 , 5 lo scopo del metodo qui presentato è di costruire, con il dosaggio ottimizzato da Nakatsu e Hughes incorporando perictyes in test, in modo che i ruoli di paracrine e juxtracrine delle cellule murale in germinazione delle cellule endoteliali possono essere incorporati in l’angiogenesi nuovi studi. I periciti sono cellule murale che sono definite dal loro ruolo come cellule che mantengono stretto contatto fisico con le cellule endoteliali a causa del loro essere incorporato nella membrana basale vascolare. 6 cellule endoteliali e periciti impegnano in complesso cross-talk tramite vie tra cui tacca di segnalazione segnalazione, Ang-Tie2, PDGFRβ, TGFRβ e molti altri. 7 , 8 modelli di Mouse carenti in queste vie di segnalazione dimostrano Pericita scarsa copertura di sviluppare il sistema vascolare nell’embriogenesi, che conduce al povero rimodellamento vascolare e sistema vascolare disfunzionale. 7 inoltre, il ruolo dei pericytes nell’angiogenesi patologica è importante ma spesso sottovalutato. Ad esempio, una caratteristica unica del sistema vascolare del tumore è che i vasi sono più immaturi, che perde e disfunzionale dovuto Pericita scarsa copertura. 9 è stato proposto che la presenza o l’assenza dei pericytes drammaticamente urta il fenotipo dei vasi sanguigni del tumore ed è un importante mediatore delle risposte alle terapie antitumorali e antiangiogenici. 9 così, compreso il ruolo dei pericytes in saggi in vitro è la chiave per catturare più completamente i meccanismi importanti di regolazione endoteliale.
Anche se ci sono molti saggi in vitro ed ex vivo attualmente impiegati per studiare l’angiogenesi, ci sono lacune di considerare in ciascuno. Alcuni, come proliferazione endoteliale e saggi di migrazione endoteliale, sono eccessivamente semplificati e concentrarsi su una funzione endoteliale in un ambiente isolato sulla plastica di coltura del tessuto. 10 altri saggi si verificano in un altro 3 dimensionale (3D), come l’analisi di formazione del tubo di Matrigel,10 ma queste analisi sono ancora molto semplificate e concentrano maggiormente sulla capacità delle cellule endoteliali per migrare e formare de novo vascolare strutture, al contrario di germinazione dal sistema vascolare pre-esistenti. Inoltre, nessuno di questi saggi incorporare tipi cellulari murale. Ci sono ex vivo modelli come l’analisi dell’aorta di anello che incorporano i periciti presenti nell’organo ospitante, ma la manipolazione genetica di questi modelli è molto più impegnativo a causa della necessità di generare modelli murini transgenici o knockout della percorsi di interesse. Il tallone di germogliatura dosaggio è ideale perché modella germogliare endoteliale, proliferazione, migrazione e formazione anche l’anastomosi e lumen in una matrice 3D. 4 il dosaggio consente fedelmente meccanicistico valutazione delle molte diverse fasi di germinazione, pur consentendo per diretta modificazione genetica delle cellule endoteliali o pericytes in un ambiente più controllato. I coaguli di fibrina contenente microsfere di germogliatura possono essere facilmente risolto, macchiati e ripreso in diverse fasi di germinazione; questi germogli possono anche essere inseriti in una camera di imaging dal vivo per eseguire la formazione immagine in tempo reale di germogliatura. La metodologia presentata qui è ideale per studiare i meccanismi di base dell’angiogenesi attraverso in phenotyping profondità e analisi approfondita delle vie attivate durante l’angiogenesi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo presenta un metodo per caratterizzare le fasi complesse e interazioni eterotipiche cellulari di germogliatura angiogenesi attivando il ricercatore di impiegare approcci genetici e imaging per condurre indagini approfondite meccanicistiche. Quando si esegue il test, è essenziale che efficiente rivestimento endoteliale delle perle si svolge durante il tallone punti di agitazione. Rivestimento endoteliale poveri saranno evidente, se le perline non sembrano avere una superficie ruvida di golf sfera-come la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la d. ssa Victoria Bautch e Joshua Boucher per utili discussioni e consigli su come ottimizzare il tallone standard spuntano condizioni di dosaggio e un saggio di germogliatura protocollo di colorazione. S.H.A. è stato sostenuto in parte da una sovvenzione dal National Institute of General Medical Sciences sotto Premio 5T32 GM007092.
Materials
| Sterile Pipette tips | VWR | ||
| Pipettors | Eppendorf | ||
| Complete EGM2 Media Bullet Kit | Lonza | CC-3162 | HUVEC Media |
| MEM | Gibco | 11095114 | 10T1/2 Media |
| DMEM | Gibco | 11965118 | NHLF Media |
| Tissue culture-grade PBS | Gibco | 14190-144 | Magnesium and calcium free |
| Accutase | Life Technologies | A1110501 | For lifting HUVEC |
| Trypsin | Life Technologies | 15050065 | For lifting 10T 1/2 and NHLF |
| Customs siRNAs | Sigma | ||
| Lipofectamine RNAiMax | Life Technologies | 13778150 | |
| HUVEC | Lonza | C2517A | |
| 10T 1/2 | ATCC | ||
| NHLF | ATCC | ||
| Cytodex 3 microcarrier beads | Sigma | C3275 | |
| Tissue culture-coated 6 and 10 cm plates | Corning | ||
| Fibrinogen from bovine plasma | Sigma | F8630 | |
| Thrombin | Sigma | t9549 | |
| Aprotinin | Sigma | a3428 | |
| Falcon Round-Bottom Tubes | Corning | ||
| Tissue culture incubator and hood | |||
| 24-well glass bottom plates | MatTek | P24G1.513F | Glass-bottom plates are needed only if the sprouts are going to be imaged. If not, tissue culture plastic is also acceptable. |
| Sterile Filtration Device |
References
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