Le protocole MPLEx pour Multi-omic Analyses d’échantillons de sol
Summary
Un protocole est présenté pour simultanément extraction de métabolites, les protéines et les lipides provenant d’un échantillon de sol unique, ce qui permet des temps de préparation d’échantillon réduite et permettre multi-omic analyses de spectrométrie de masse des échantillons avec des quantités limitées.
Abstract
Spectrométrie de masse (MS)-fonction intégrée metaproteomic, métabolomique et études lipidomic (multi-omic) transforment notre capacité de comprendre et de caractériser des communautés microbiennes dans les systèmes biologiques et environnementales. Ces mesures permettent même des analyses améliorées des communautés microbiennes des sols complexes, qui sont les plus complexes systèmes microbiens connus à ce jour. Multi-omic analyses, cependant, ont défis d’échantillon de préparation, car séparé les extractions sont généralement nécessaires pour chaque étude omic, amplifiant ainsi considérablement le temps de préparation et de la quantité d’échantillon requis. Pour combler cette lacune, une méthode 3-en-1 pour l’extraction simultanée des métabolites, des protéines et des lipides (MPLEx), partir du même échantillon de sol a été créé en adaptant une approche à base de solvant. Ce protocole MPLEx s’est avéré pour être simple et robuste pour de nombreux types d’échantillons, même lorsqu’utilisé pour des quantités limitées d’échantillons de sol complexes. La méthode MPLEx activé aussi grandement les mesures rapide multi-omic nécessaires pour acquérir une meilleure compréhension des membres de chaque communauté microbienne, tout en évaluant les changements qui se produisent lors de perturbations biologiques et environnementale.
Introduction
Évaluation des communautés microbiennes du sol a des implications importantes pour la compréhension de carbone vélo et le changement climatique. Des études récentes ont cependant mis en évidence des difficultés, telles que l’absence de génomes séquencés pour microbiote dans divers types de sols et de la fonction inconnue de la plupart des protéines détectées. Résultat de ces défis en raison du sol étant la communauté microbienne plus complexe connue à ce jour1,2,3. Des analyses multi-omic qui combinent les résultats de la métagénomique, metatranscriptomic, metaproteomic, métabolomique et lipidomic études, ont récemment été mis en œuvre dans de nombreuses études de sol pour mieux connaître dans les microbes présents, tout en obtenir des informations complètes sur les changements moléculaires qui aura lieu en raison de perturbations de l’environnement1,4,5. Un défi avec multi-omic études est que la spectrométrie de masse (MS)-base de mesures metaproteomic, métabolomique et lipidomic exigent généralement un procédé d’extraction spécifique pour chaque omic MS compatible6,7 , 8 , 9. ces procédures précises font leur mise en œuvre extrêmement difficile, voire impossible lorsque seule une quantité limitée de l’échantillon est disponible. Ces défis nous ont incités à étudier une simultanée métabolite, protéines et lipides (MPLEx) méthode d’extraction capable d’utiliser des petits volumes d’échantillon ou de masses, améliorer la précision et fournissant des préparations plus rapides pour tous les trois analyses 10. a ce jour, il n’y a aucune procédure d’extraction de sol remplaçant qui peut atteindre tous ces objectifs.
Pour activer le multi-omic global analyse d’un échantillon de sol unique, un protocole d’extraction par solvant organique basé sur le chloroforme méthanol et séparations d’eau a été utilisé10. Cette méthode a été développée pour les extractions de lipides totaux9,11 et plus récemment a été modifiée pour l’extraction simultanée des métabolites, des protéines et des lipides d’un seul échantillon12,13 ,14,15,16,17,18,19,20,21,22, 23,24,25,26,27,28,29,30, ce qui permet de la moindre quantité d’échantillon et 10de la variabilité expérimentale. Dans le protocole MPLEx, chloroforme n’est pas miscible avec l’eau, qui constitue la base de la triphasique la séparation chimique des constituants de l’échantillon en fractions distinctes. La phase aqueuse supérieure contient donc les métabolites hydrophiles, suivies d’un disque de protéine, puis une couche de lipides dans la phase chloroformique bas (Figure 1). Lorsque MPLEx est appliqué à la plupart des sols, débris particulaires s’accumule au bas des tubes d’échantillonnage et peuvent être ignorées après que tous les calques sont collectées. Chaque type de sol peut être différent, cependant et dans un sol très organique tels que de la tourbe, les débris du sol reste dans la couche intermédiaire et ne tombent pas au fond du tube d’échantillonnage. MPLEx offre plusieurs avantages lorsque isoler une molécule plusieurs types du même échantillon, tels que 1) plus petites quantités d’échantillon peuvent être utilisées pour les analyses multi-omic, les extractions de la même diminution de l’échantillon 2) multi-omic variabilité expérimentale dans l’ensemble, et 3) un plus grand nombre d’échantillons peut être préparé beaucoup plus vite pour un débit plus élevé studies10. Ensemble, ces avantages sont essentiels pour fournir de meilleures capacités de mesure permettant d’évaluer des échantillons de sol et de leurs communautés microbiennes complexes.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il est important de noter que pas tous les laboratoires auront le même équipement disponible pour certaines méthodes, par exemple l’étape de lyse, peuvent être adaptés. Ici, nous utilisons vortex et la sonification, cependant l’utilisation d’un batteur de perle grand 50 mL fonctionnerait. Si un lyophilisateur avec une température collecteur capable de-105 ° C n’est pas disponible, les échantillons peuvent être séchés sous courant d’azote. Aussi les types de sol varient considérablement et peuvent i…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs tiennent à remercier Nathan Johnson pour son aide dans la préparation des chiffres. Cette recherche a été soutenue par le programme Pan-omics qui est financé par le U.S. Department of Energy Office of Biological and Environmental Research (programme des sciences génomiques) les Microbiomes en Transition (MinT) laboratoire réalisé recherche développement Initiative à la Pacific Northwest National Laboratory, ainsi que le National instituts de santé National Institute de Environmental Health Sciences (R01 ES022190) et le NIH (P42 ES027704). KEBJ tiens à remercier R21 HD084788 pour un soutien financier élaborer et valider des techniques d’extraction de nouveaux multi-omic. Cette œuvre était jouée dans W. R. Wiley environnement moléculaire Sciences Laboratory (EMSL), une installation utilisateur scientifique national de DOE à la Pacific Northwest National Laboratory (PNNL). PPNL est un laboratoire national multi-programme exploité par Battelle pour l’entité opérationnelle désignée en vertu du contrat DE-AC06-76RL01830.
Materials
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498 | Stored at -20°C !Caution chloroform has acute potential health effects, skin irritation and possible chemical burns, irritation to the respiratory system, may affect the kidneys, liver, heart. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860 | Stored at -20°C !Caution Methanol may cause respiratory tract, skin and eye irritation, may damage the nerves, kidneys and liver. Wear suitable protective glasses, clothing and gloves, work in a fume hood. |
| Purified water from Millipore | Milli-Q | Water purification system. | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma-Aldrich | L6026 | !Caution SDS causes acute toxicity and is flammable. It is a skin, eye and airway irritant. Wear gloves and safety glasses. |
| Soil protein extraction kit | MoBio, NoviPure Soil Protein Extraction Kit, Qiagen | 30000-20 | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| 1M Trizma HCL | Sigma-Aldrich | T2694 | |
| Trichloroacetic acid | Sigma-Aldrich | T0699 | !Caution TCA is caustic, toxic and may cause skin burns. Wear gloves and safety glasses. |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 650501 | Stored at -20°C !Caution Acetone may cause respiratory tract and skin and eye irritation. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses gloves and a lab coat, work in a fume hood. |
| Urea | Sigma-Aldrich | 208884 | !Caution Urea is an eye and skin irritant, use gloves and safety glasses |
| Ammonium bicarbonate | Fluka | 09830 | |
| Trypsin | Promega | V528A | 20µg vials |
| Bicinchoninic acid protein assay kit | Pierce | 23227 | |
| Ammonium Formate | Sigma-Aldrich | 09735 | |
| Acetonitrile | Sigma-Aldrich | 34998 | !Caution Acetonitrile is a skin and eye irritant. Highly flammable. Wear gloves and safety glasses. Work in a fume hood. |
| Trifluoroacetic acid | Sigma-Aldrich | T6508 | !Caution TFA is extremely hazardous in case of skin contact, eye contact, ingestion and inhalation. May produce tissue damage particularly on mucous membranes of eyes, mouth and respiratory tract. Skin contact may produce burns. Wear gloves, lab coat, safety glasses and work in a fume hood. |
| Methoxyamine hydrochloride | Sigma-Aldrich | 226904 | !Caution Methoxyamine hydrochloride causes severe burns and serious damage to eyes, may cause sensitization by skin contact. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Pyridine | Sigma-Aldrich | 270970 | !Caution Pyridine can cause skin and eye irritation, central nervous system depression. Vapor may cause flash fire. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| N-Methyl-N-(trimethylsilyl)trifluoroacetamide with 1% trimethylchlorosilane | Sigma-Aldrich | 69478 | !Caution MSTFA + 1% TMCS can cause skin corrosion, serious eye damage and specific target organ toxicity. Flammable liquid and vapor. Wear safety glasses, gloves and lab coat, work in a fume hood. |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9541 | |
| Milli-Q water purification system | Millipore | model MPGP04001 | |
| Vortex | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Probe sonicator | FisherBrand | model FB505 | |
| Refrigerated centrifuge | Eppendorf | model 5810R | |
| 50mL tube swinging bucket rotor | Eppendorf | A-4-44 | |
| 50mL fixed angle rotor | Eppendorf | FA-45-6-30 | |
| Balance | OHAUS | model V22PWE150IT | |
| Serological pipette controller | Eppendorf | 12-654-100 | |
| 10mL, 25mL glass serological pipettes | FisherBrand | 13-678-27F, 13-678-36D | |
| Thermomixer with Thermotop | Eppendorf | 5382000015, 5308000003 | |
| 0.9 – 2.0 mm blend stainless steel beads | NextAdvance | SSB14B | |
| 0.15 mm garnet beads | MoBio | 13122-500 | |
| Magnetic stir plate | FisherBrand | 11-100-16SH | |
| Magnetic stir bar | FisherBrand | 14512130 | |
| pH paper strips, pH range 0–14 | FisherBrand | M95903 | |
| 15mL, 50mL conical polypropylene centrifuge tube | Genesee Scientific | 21-103 21-108 | chloroform compatible |
| 50mL vortex attachment | MoBio | 13000-V1-50 | |
| Ice bucket | FisherBrand | 02-591-44 | |
| 27.25x70mm glass vials | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Breathe Easier plate membranes | Midwest Scientific | BERM-2000 | |
| Alcohol wipes | Diversified Biotech | BPWP-1000 | |
| Heater shaker incubator | Benchmark, Incu-Shaker Mini | ||
| Analog rotisserie tube rotator | SoCal BioMed, LLC | 82422001 | |
| Filter-Aided-Sample-Prep kit | FASP; Expedeon | 44250 | |
| Microplate reader | Biotek, EPOCH | ||
| -20 Degree Celsius Freezer | Fisher | 13986149 | |
| -80 Degree Celsius Freezer | Stirling Ultracold | SU78OUE | |
| Q-Exactive ion trap mass spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Agilent 7890A gas chromatograph coupled with a single quadrupole 5975C mass spectrometer | Agilent Technologies, Inc. | ||
| LTQ-Orbitrap Velo | Thermo Scientific | ||
| Waters NanoEquityTM UPLC system | Millford, MA | ||
| 250mL media bottle | FisherBrand | 1395-250 | |
| Waters vial | Waters | 186002805 | |
| Glass MS sample vial and inserts | MicroSolv | 9502S-WCV, 9502S-02ND | |
| Glass HPLC vial and snap caps | MicroSolv | 9512C-0DCV, 9502C-10C-B | |
| HPLC 96-well plate | Agilent | 5042-6454 | |
| Large glass vial 27.25x70mm | FisherBrand | 03-339-22K | |
| Lyophilizer | Labconco | 7934021 | |
| Polished stainless steel flat head spatula | Spoonula; FisherBrand | 14-375-10 | |
| Kim wipes | Kimberly-Clark | 34721 | |
| XBridge C18, 250×4.6 mm, 5 μM with 4.6×20 mm guard column | Waters | 186003117, 186003064 | |
| Agilent 1100 series HPLC system | Agilent Technologies | G1380-90000 | |
| 1.7mL centrifuge tube | Sorenson | 11700 | |
| Hamilton Glass Syringes, 5mL, 50µL and 250µL | Hamilton | 81517, 80975, 81175 | |
| Pasteur Pipettes | FisherBrand | 13-678-20A | |
| Pasteur Pipette Bulbs | Sigma-Aldrich | Z111597 | |
| Bath Sonicator | Branson 1800 Ultrasonic Cleaner | ||
| Vacuum Centrifuge | Labconco Centrivap Acid-Resistant Concentrator System | ||
| MicroSpin Columns, C18 Silica | The Nest Group | SEM SS18V | |
References
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