استخدام "المحطة الطرفية ترانسفيراز" بوساطة dUTP نك نهاية الوسم (TUNEL) و Caspase 3/7 فحوصات "تدبير موت الخلايا البشرة" في الضفادع مع تشيتريديوميكوسيس
Summary
نحن كمياً موت الخلايا البشرة في الضفادع مع chytridiomycosis استخدام أسلوبين. أولاً، نحن نستخدم المحطة الطرفية dUTP ترانسفيراز بوساطة نك نهاية الوسم (TUNEL) في الموقع علم الأنسجة لتحديد الاختلافات بين الحيوانات المصابة وغير مصاب سريرياً. ثانيا، نقوم تحليل السلاسل الزمنية للمبرمج على مدى الإصابة باستخدام تحليل بروتين caspase 3/7.
Abstract
البرمائيات تعاني من خسائر كبيرة في التنوع البيولوجي على الصعيد العالمي وهو أحد الأسباب الرئيسية تشيتريديوميكوسيس الأمراض المعدية. يحدث هذا المرض بسبب مسببات الأمراض الفطرية ديندروباتيديس باتراتشوتشيتريوم (Bd)، الذي يصيب ويعطل الضفدع البشرة؛ ومع ذلك، التغييرات المرضية لا صراحة تميزت. المبرمج (موت الخلايا المبرمج) يمكن أن يستخدمها مسببات الأمراض إلى تلف أنسجة المضيف، ولكن يمكن أيضا أن تكون إليه مضيف لمقاومة المرض لإزالة مسببات المرض. في هذه الدراسة، ونحن التحديد الكمي لموت الخلايا البشرة من الحيوانات المصابة وغير مصاب باستخدام فحوصات مختلفة اثنين: المحطة الطرفية dUTP ترانسفيراز بوساطة نك نهاية الوسم (TUNEL)، وكاسباسي 3/7. استخدام البطني، الظهرية، وأنسجة الجلد الفخذ في مقايسة TUNEL، نلاحظ خلية موت في خلايا البشرة في الموقع للحيوانات المصابة سريرياً ومقارنة موت الخلية مع الحيوانات مصابة باستخدام مجهر فلوري. من أجل تحديد كيفية تغيير مستويات المبرمج في البشرة على مدى الإصابة بإزالة عينات تو-نصيحة كل أسبوعين لمدة 8 أسابيع، واستخدام الإنزيم caspase 3/7 مع البروتينات المستخرجة لقياس النشاط داخل العينات. ثم أننا ربط النشاط caspase 3/7 مع التحميل العدوى. والرزن TUNEL مفيد للترجمة من خلية موت في الموقع، ولكن مكثفة باهظة التكلفة والوقت لكل عينة. والرزن caspase 3/7 بكفاءة للعينات ذات الأحجام الكبيرة والوقت طبعا التجارب. لأن الضفدع إصبع نصيحة خزعات صغيرة هناك غير استخراج محدود متاح لتوحيد نموذج عن طريق أساليب القياس الكمي البروتين، مثل فحص برادفورد. ولذلك، فإننا نقترح تقدير مساحة سطح الجلد من خلال تحليل الصور الفوتوغرافية خزعات أخمص القدمين تجنب المستهلكة مقتطفات من خلال توحيد عينة.
Introduction
البرمائيات هي تعاني حاليا من أحد أكبر خسائر التنوع البيولوجي العالمي من أي الأصناف الفقارية1. هو سبب رئيسي لهذه الانخفاضات chytridiomycosis الأمراض الجلدية القاتلة، الناجمة عن مسببات الأمراض الفطرية باتراتشوتشيتريوم dendrobatidis، دينار بحريني2. مسببات المرض سطحي يصيب البشرة، مما قد يؤدي إلى تعطيل وظيفة الجلد أسفر عن خسارة الكهرباء الشديدة والسكتة القلبية والموت3. المختلفة المحتملة المضيف آليات محصنة ضد دينار بحريني وتجري حاليا دراسة، مثل الببتيدات المضادة للميكروبات4،5، النباتات البكتيرية الجلدية6،7،مستقبلات الخلايا المناعية8 واللمفاويات النشاط9،10. ومع ذلك، قليلة هي الدراسات استكشاف ما إذا كان الموت المبرمج وخلية البشرة إليه محصنة ضد هذا الممرض القاتل.
قد يكون موت الخلايا، أما عن طريق المبرمج (موت الخلايا المبرمج) أو نخر (موت غير المبرمج)، في البشرة أمراض العدوى دينار بحريني . وتشير البحوث السابقة أن العدوى دينار بحريني قد حمل المبرمج لأنه لوحظ تعطل تقاطعات داخل الخلايا عندما يتعرض الجلد explants zoospore supernatants في المختبر11. بالإضافة إلى ذلك، التغيرات التنكسية البشرة في دينار بحريني-ولوحظت الضفادع المصابة باستخدام الميكروسكوب الإلكتروني12،13. تحليلات ترانسكريبتوميك تشير إلى أن مسارات المبرمج أوبريجولاتيد في الجلد المصابة14، والخضوع سبلينوسيتيس البرمائية المبرمج عندما يتعرضون إلى سوبيرناتانتس دينار بحريني في المختبر15. وعلى الرغم من تزايد حجم الأدلة التي تشير إلى أنه يمكن أن يستحث دينار بحريني الخلية المبرمج والمضيف الموت في المختبر، دراسات في فيفو استكشاف أو التحديد الكمي للمبرمج تفتقر إلى الآليات من خلال تطور الإصابة. علاوة على ذلك، فإنه غير معروف إذا كان المضيف يستخدم المبرمج كاستراتيجية دفاعية محصنة لمكافحة العدوى دينار بحريني ، أو إذا كان المبرمج علم راض مرض.
في هذه الدراسة، ونحن تهدف إلى الكشف عن موت الخلايا البشرة والمبرمج في الحيوانات المصابة في فيفو استخدام أسلوبين: مقايسة البروتين caspase 3/7، ومحطة dUTP ترانسفيراز بوساطة نك نهاية الوسم (TUNEL) في الموقع المقايسة. كما يكشف فحص كل الجوانب المختلفة للخلية وفاة16، معا هذه الأساليب توفير فهم كامل للآليات التي تشارك في موت الخلايا، وضمان مقياس دقيق للأثر. يقد الإنزيم caspase 3/7 نشاط caspases المستجيب 3 و 7، الذي يتيح للتحديد الكمي لمسارات المبرمج الذاتية والخارجية على حد سواء. وفي المقابل، يكشف الإنزيم TUNEL تجزؤ الحمض النووي، الذي يحدث بسبب آليات موت الخلية بما في ذلك المبرمج ونخر بيروبتوسيس17. نحن نستخدم الإنزيم TUNEL للتحقيق في موقع موت الخلية داخل البشرة الحيوانات المصابة سريرياً ومصابة باستخدام ثلاثة أقسام مختلفة من الجلد: في دورسوم وفنتر والفخذ من كوروبوري بسيودوفريني. ويحدد هذا الأسلوب في موقع تشريحي لموت الخلايا، فضلا عن التمييز بين موقعها داخل طبقات البشرة محددة. ثم نستخدم الإنزيم caspase 3/7 لإجراء تحديد كمي سلسلة وقت المبرمج طوال 8 أسابيع عدوى في البينا فيريوكسي ليتوريا. نحن أخذ عينات نصيحة أخمص القدمين مرة كل أسبوعين من الحيوانات نفسها، وقادرة على ربط تحميل العدوى الممرض بنشاط caspase 3/7.
Protocol
Representative Results
Discussion
وبحثنا في المبرمج البشرة وموت الخلية كآلية محتملة لعلم الأمراض chytridiomycosis المرض القاتل أو إليه لمقاومة الأمراض في الأنواع عرضه دينار بحريني . قمنا باستخدام أسلوبين لتقييم موت الخلايا في البشرة والمقايسة TUNEL في الموقع خلية البشرة الموت تحليل، والمقايسة caspase 3/7 لرصد موت الخلايا الب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ونحن نشكر الأشخاص التالية أسماؤهم الذين ساعدوا بتربية وجمع البيانات: تيجتميير دال، جيم دي يونغ، هوكس J.، فوسين ك.، برسيفال س.، McWilliams م.، بيرتولا L.، م. ستيوارت، هارني أ. ونبيل ت.؛ ومرسيس م. للحصول على المساعدة مع تشريح. كما نود أن نشكر مكفادين م.، هارلو ص وحديقة تارونغا لرفع مستوى ل. ف. البينا، وزاي مارانتيلي لرفع كوروبوري P.. ونشكر باسمانس واو، ألف مارتل لإسداء المشورة بشأن فحوصات المبرمج، قسطنطين جيم، كلادنيك ألف وويب ر. للحصول على المساعدة مع الإنزيم TUNEL، واميتو ت. ووكر Weßels لمساعدة مع البروتوكول وطقم للمقايسة caspase 3/7. هذه المخطوطة والبروتوكول هو مقتبس من برانيلي وآخرون عام 2017 الأقران ي22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
- Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
- Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
- Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
- Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
- Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
- Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
- Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
- Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
- Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
- Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
- Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
- Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
- Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
- Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
- Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
- Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).
