Met behulp van Terminal Transferase-gemedieerde dUTP testen Nick einde-etikettering (TUNEL) en Caspase-3/7 aan maatregel epidermale celdood in kikkers met Chytridiomycosis
Summary
We kwantificeren epidermale celdood in kikkers met chytridiomycosis met twee methoden. Ten eerste, we gebruiken terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) in situ histologie om verschillen tussen klinisch besmette en niet-geïnfecteerde dieren te bepalen. Ten tweede, wij voeren een tijdreeksanalyse van apoptosis over infectie met behulp van een caspase-3/7 eiwit analyse.
Abstract
Amfibieën ondervinden een groot verlies aan biodiversiteit wereldwijd en een van de belangrijkste oorzaken is de chytridiomycosis van infectieziekten. Deze ziekte wordt veroorzaakt door de schimmel pathogeen Batrachothrychium dendrobatidis (Bd), die infecteert en verstoort kikker epidermis; echter, pathologische veranderingen hebben niet expliciet gekenmerkt. Apoptose (geprogrammeerde celdood) kan kan worden gebruikt door ziekteverwekkers te beschadigen gastheer weefsel, maar ook een mechanisme van de gastheer van ziekteresistentie voor pathogen verwijdering. In deze studie, kwantificeren we epidermale celdood van besmette en niet-geïnfecteerde dieren met behulp van twee verschillende testen: terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) en caspase-3/7. Gebruik van ventrale, dorsal, en dij huidweefsel in de TUNEL assay, we observeren cel dood in de epidermale cellen in situ van klinisch besmette dieren en celdood vergelijken met niet geïnfecteerde dieren met behulp van fluorescentie microscopie. Om te bepalen hoe apoptosis niveaus in de epidermis veranderen in de loop van infectie we Verwijder teen-tip monsters twee weken over een 8-weekse periode en gebruik een caspase-3/7-assay met uitgepakte eiwitten te kwantificeren activiteit binnen de monsters. Wij vervolgens correleren caspase-3/7 activiteit met infectie belasting. De TUNEL assay is handig voor lokalisatie van cel dood in situ, maar is duur en tijd intensieve per monster. Het caspase-3/7-assay is efficiënt voor grote steekproeven en tijd cursus experimenten. Omdat kikker teen tip biopsieën klein zijn echter er beperkt extract beschikbaar voor monster normalisatie via eiwit kwantificering methoden, zoals de analyse van Bradford. Daarom is het raadzaam het schatten van de totale oppervlakte van de huid door middel van fotografische analyse van Teen biopsieën om extracten te consumeren tijdens monster normalisatie.
Introduction
Amfibieën zijn momenteel een de grootste verlies van mondiale biodiversiteit van alle gewervelde taxa1. Een belangrijke oorzaak van deze daling is de fatale huid ziekte chytridiomycosis, veroorzaakt door de schimmel pathogeen Batrachothrychium dendrobatidis, Bd2. Het pathogene agens oppervlakkig infecteert de epidermis, die kan leiden tot verstoring van de functie van de huid leidt tot ernstige elektrolyt verlies, hartstilstand en overlijden3. Verschillende potentiële gastheer immuun mechanismen tegen Bd worden momenteel bestudeerd, zoals antimicrobiële peptiden4,5, cutane bacteriële flora6, immuun cel receptoren7,8, en lymfocyt activiteit9,10. Echter onderzoeken weinig studies of epidermale apoptosis en cel dood een immuun mechanisme tegen dit dodelijke pathogenen is.
Celdood, apoptosis (geprogrammeerde celdood) of necrose (unprogrammed dood), in de epidermis mogelijk een pathologie van Bd infectie. Vorige onderzoek suggereert dat Bd infectie apoptosis veroorzaken kan, omdat verstoring van de intracellulaire kruispunten wordt waargenomen wanneer huid explantaten zijn blootgesteld aan Zoöspore supernatant in vitro11. Bovendien, degeneratieve epidermale veranderingen in Bd-besmette kikkers zijn waargenomen met behulp van elektronenmicroscopie12,13. Transcriptomic analyses geven aan dat apoptosis trajecten upregulated in geïnfecteerde huid14 zijn, en wormsalamanders splenocytes ondergaan apoptosis wanneer ze worden blootgesteld aan Bd supernatant in vitro15. Ondanks de groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat Bd kan veroorzaken cel apoptosis en de gastheer dood in vitro, in vivo studies die onderzoeken of het kwantificeren van apoptosis mechanismen door de progressie van de infectie ontbreken. Het is verder onbekend, gebruikt de host dit apoptosis als een defensieve immuun strategie ter bestrijding van Bd infectie of apoptosis is een pathologie van ziekte.
In deze studie, we gericht op het detecteren van epidermale celdood en apoptosis in besmette dieren in vivo met behulp van twee methoden: caspase-3/7 eiwit assay en terminal transferase-gemedieerde dUTP nick einde-etikettering (TUNEL) in situ assay. Zoals elke bepaling verschillende aspecten van cel dood16 detecteert, samen deze methoden geven een volledig inzicht in de mechanismen die betrokken zijn bij de dood van de cel en zorgen voor een nauwkeurige meting van het effect. Het caspase-3/7-assay kwantificeert de activiteit van effector caspases 3 en 7, waarmee kwantificering van zowel de intrinsieke en extrinsieke apoptosis trajecten. In tegenstelling, detecteert de TUNEL assay fragmentatie van DNA, die wordt veroorzaakt door cel dood mechanismen, met inbegrip van apoptosis, necrose en pyroptosis17. We gebruiken de TUNEL bepaling te onderzoeken van de locatie van de dood van de cel binnen de epidermis van zowel klinisch besmette en niet-geïnfecteerde dieren met behulp van drie verschillende huid secties: het dorsum, de venter en de dij van Pseudophryne corroboree. Deze methode geeft de anatomische site van celdood, evenals de locatie binnen specifieke epidermale lagen onderscheid te maken. Vervolgens gebruiken we de caspase-3/7-bepaling uit te voeren een tijd serie kwantificering van apoptosis in een 8-weekse infectie in Litoria verreauxii alpina. We nemen teen tip monsters twee weken uit dezelfde dieren en zijn in staat om pathogenen infectie belasting correleren met caspase-3/7 activiteit.
Protocol
Representative Results
Discussion
Verkenden we epidermale apoptosis en dood van de cel als een potentiële mechanisme van de pathologie van de dodelijke ziekte chytridiomycosis of een mechanisme van ziekteresistentie bij Bd vatbare soorten. We gebruikten twee methoden voor de beoordeling van de dood van de cel in de opperhuid, TUNEL assay voor in situ epidermale cell death analyse en caspase-3/7 assay voor het toezicht op de epidermale celdood tijdens de voortgang van de infectie. Wij vonden dat celdood en apoptosis worden gecorreleerd …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken de volgende mensen die met veeteelt en gegevensverzameling geholpen: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertola, M. Stewart, N. Harney en T. Knavel; en M. Merces voor hulp bij dissecties. Wij zouden ook willen bedanken M. McFadden, P. Harlow en Taronga Zoo voor het aantrekken van de L. v. alpinaen G. Marantelli voor het aantrekken van de P. corroboree. Wij danken F. Pasmans, A. Martel voor advies over apoptosis testen, C. Constantine, A. Kladnik en R. Webb voor hulp bij TUNEL assay, en T. Emeto en W. Weßels voor hulp bij protocol en kit voor caspase-3/7 assay. Dit manuscript en het protocol is aangepast van Brannelly et al. 2017 Peer J22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
- Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
- Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
- Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
- Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
- Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
- Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
- Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
- Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
- Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
- Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
- Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
- Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
- Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
- Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
- Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
- Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).
