Ved hjælp af Terminal-Transferase-medieret dUTP Nick ende-mærkning (TUNEL) og Caspase 3/7-undersøgelser til foranstaltning Epidermal celledød i frøer med Chytridiomycosis
Summary
Vi kvantificere epidermal celledød i frøer med chytridiomycosis ved hjælp af to metoder. Først bruger vi terminal-transferase-medieret dUTP nick ende-mærkning (TUNEL) i situ histologi for at bestemme forskellene mellem klinisk inficeret og ikke-inficerede dyr. Andet, foretager vi en tids-serie analyse af apoptose over infektion ved hjælp af en caspase 3/7 proteinanalyse.
Abstract
Padder oplever et stort tab i biodiversiteten globalt og en af de vigtigste årsager er den smitsomme sygdom chytridiomycosis. Denne sygdom er forårsaget af de svampe patogen Batrachochytrium dendrobatidis (Bd), som inficerer og forstyrrer frøen epidermis; men patologiske ændringer er ikke blevet udtrykkeligt karakteriseret. Apoptose (programmeret celledød) kan bruges af patogener til at skade værten væv, men kan også være en vært mekanisme af sygdomsresistens for patogenet fjernelse. I denne undersøgelse, vi kvantificere epidermal celledød af smittede og ikke-inficerede dyr ved hjælp af to forskellige assays: terminal-transferase-medieret dUTP nick ende-mærkning (TUNEL) og caspase 3/7. Bruger ventrale, rygfinne, og lår hudvæv i TUNEL assay, vi observerer celle død i epidermal celler i situ af klinisk inficerede dyr og sammenligne celledød med ikke-inficerede dyr ved hjælp af fluorescerende mikroskopi. For at afgøre, hvordan apoptose niveauer i epidermis ændrede løbet af infektion vi fjerne tå-tip prøver hver fjortende dag over en 8-ugers periode, og bruge en caspase 3/7 assay med udvundne proteiner til at kvantificere aktivitet inden for prøverne. Vi derefter korrelere caspase 3/7 aktivitet med infektion belastning. TUNEL assay er nyttig for lokalisering af celle død i situ, men er dyre og tid intensive pr. prøve. Caspase 3/7 assay er effektiv til store stikprøvestørrelser og tid kursus eksperimenter. Men fordi frøen tå tip biopsier er små der er begrænset ekstrakt tilgængelige for prøven standardisering via protein kvantificering metoder, såsom Bradford assay. Vi foreslår derfor, estimering hud overflade område gennem fotografiske analyse af tå biopsier at undgå indtagelse af ekstrakter under prøven standardisering.
Introduction
Padder i øjeblikket oplever en de største tab af globale biodiversitet af ethvert hvirveldyr taxa1. En væsentlig årsag til disse afvisninger er fatal hud sygdom chytridiomycosis, forårsaget af de svampe patogen Batrachochytrium dendrobatidis, Bd2. Patogenet inficerer overfladen epidermis, som kan føre til afbrydelse af hudens funktion resulterer i alvorlige elektrolyt tab, hjertestop og død3. Forskellige potentielle vært immun mekanismer mod Bd er i øjeblikket ved at blive undersøgt som antimikrobielle peptider4,5, kutane bakterieflora6, immun celle receptorer7,8, og lymfocyt aktivitet9,10. Men få undersøgelser udforske om epidermal apoptose og celle død er en immun mekanisme mod denne dødbringende patogen.
Celledød, enten gennem apoptose (programmeret celledød) eller nekrose (unprogrammed død), i epidermis kan være en patologi af Bd infektion. Tidligere forskning tyder på, at Bd infektion kan inducere apoptose, fordi afbrydelse af intracellulære knudepunkter er observeret, når huden explants er udsat for zoospore analysere in vitro-11. Derudover degenerative epidermal ændringer i Bd-inficerede frøer er observeret ved hjælp af elektronmikroskopi12,13. Transkriptom analyser viser, at apoptose veje er upregulated i inficeret hud14, og padde splenocytes gennemgå apoptose, når de udsættes for Bd analysere in vitro-15. Trods den stigende mængde af beviser tyder på, at Bd kan inducere celle apoptose og vært død i vitro, i vivo studier, udforske eller kvantificere apoptose mekanismer gennem progression af infektion mangler. Yderligere, det er ukendt, hvis værten bruger apoptose som en defensiv immunsystemet strategi til bekæmpelse af Bd infektion, eller hvis apoptose er en patologi af sygdom.
I denne undersøgelse, vi har til formål at påvise epidermal celledød og apoptose i inficerede dyr i vivo ved hjælp af to metoder: caspase 3/7 protein assay og terminal-transferase-medieret dUTP nick ende-mærkning (TUNEL) i situ assay. Som hvert assay registrerer forskellige aspekter af celle død16, sammen disse metoder giver en fuld forståelse af de mekanismer, der er involveret i celledød, og sikre en nøjagtig måling af effekten. Caspase 3/7 assay kvantificerer aktiviteten af effektor caspases 3 og 7, som giver mulighed for kvantificering af både den indre og ydre apoptose veje. Derimod registrerer TUNEL assay DNA opsplitning, som er forårsaget af celle død mekanismer, herunder apoptose og nekrose pyroptosis17. Vi bruger TUNEL analysen for at undersøge placeringen af celledød i epidermis af både klinisk inficeret og ikke-inficerede dyr ved hjælp af tre forskellige hud sektioner: dorsum, venter og lår af Pseudophryne corroboree. Denne metode identificerer den anatomiske site af celledød, samt skelne dens placering inden for specifikke epidermale lag. Derefter bruger vi caspase 3/7 analysen til at gennemføre en gang serie kvantificering af apoptose i hele en 8-ugers infektion i Litoria verreauxii alpina. Vi tager tå tip prøver hver fjortende dag fra de samme dyr og er i stand til at korrelere patogen infektion belastning med caspase 3/7 aktivitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi udforskede epidermal apoptose og celledød som en potentiel mekanisme af patologi af dødbringende sygdom chytridiomycosis eller en mekanisme for sygdomsresistens i Bd modtagelige arter. Vi brugte to metoder til vurdering af celledød i epidermis, TUNEL assay for i situ epidermal celle død analyse og caspase 3/7 analysen til overvågning af epidermale celledød i hele forløbet af infektionen. Vi fandt, at celledød og apoptose er korreleret med infektion belastning og celledød er betydeligt højer…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vil gerne takke følgende personer, der har bistået med dyrehold og dataindsamling: D. Tegtmeier, C. De Jong, J. Hawkes, K. Fossen, S. Percival, M. McWilliams, L. Bertoia, M. Stewart, N. Harney og T. Knavel; og M. Merces for bistand med dissektioner. Vi vil også gerne takke M. McFadden, P. Harlow og Taronga Zoo for at hæve L. v. alpinaog G. Marantelli til at hæve P. corroboree. Vi takker F. Pasmans, A. Martel for rådgivning om apoptose assays, C. Constantine, A. Kladnik og R. Webb for bistand med TUNEL assay, og T. Emeto og W. Weßels for hjælp med protokollen og kit til caspase 3/7 assay. Dette manuskript og protokollen er tilpasset fra Brannelly mfl 2017 Peer Jørgensen22.
Materials
| POLARstar Omega | BMG Labtech | Luminescent plate reader | |
| 384 well flat clear bottom plate | Corning | 3707 | |
| 384 well low flange white flat bottom plate | Corning | 3570 | |
| Agar Bacteriological (Oxoid) | Fisher | OXLP0011B | |
| Formal-Fixx 10% Neutral Buffered Formalin | Fisher | 6764254 | |
| Lactose Broth (Oxoid) | Fisher | OXCM0137B | |
| Sodium Bicarbonate | Fisher | BP328-500 | |
| Tricane-S (MS-222) | Fisher | NC0872873 | |
| Tryptone | Fisher | BP1421-500 | |
| Bovine Serum Albumin | Invitrogen | 15561020 | |
| Sterile rayon swab | Medical Wire & Equipment | MW-113 | |
| ApopTag Red In Situ Apoptosis Detection Kit | Merck Millipore | S7165 | |
| Coomassie Bradford reagent | Pierce | 23200 | |
| Caspase Glo 3/7 | Promega | G8090 | |
| HEPES buffer | Sigma Aldrich | H0887-20ML | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | 1374248-1G | |
| Gelatin hydrolysate Enzymatic | Sigma-Aldrich | G0262 | |
| PBS (Phosphate Buffered Saline), pH 7.2 (1X) | Thermo/Life | 20-012-043 | |
| Prepman | Thermo/Life | 4318930 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher | 4444556 | |
| Parafilm | Bemis | PM996 | |
| Clorox bleach | Clorox | ||
| Ethanol, 200 Proof, Molecular Grade | Fisher | BP2818500 | |
| ZEISS Axio Scan florescent miscroscope | Carl Zeiss | Florescent microscope | |
| 3.2mm stainless steel beads | BioSpec | 11079132SS | |
| Primer ITSI-3 Chytr (5′-CCTTGATATAATACAGTGTGCCATATGTC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Primer 5.8S Chytr (5′-TCGGTTCTCTAGGCAACAGTTT-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Minor groove binder probe Chytr MGB2(5′-CGAGTCGAAC-3′) | Taqman | Individual design for primers and probe | |
| Rotor-Gene qPCR Instruments | Qiagen | qPCR machine | |
| Microcentrifuge tubes 1.5ml | Fisher | 02-681-372 | |
| Cell culture petri plates | Nunc | 263991 | |
| Mini-beadBeater Zircornia-Silicate Beads, 0.5mm | BioSpec | 11079105Z |
References
- Stuart, S. N., et al. Status and trends of amphibian declines and extinctions worldwide. Science. 306 (5702), 1783-1786 (2004).
- Skerratt, L. F., et al. Spread of chytridiomycosis has caused the rapid global decline and extinction of frogs. EcoHealth. 4, 125-134 (2007).
- Voyles, J., et al. Pathogenesis of chytridiomycosis, a cause of catastrophic amphibian declines. Science. 326 (5952), 582-585 (2009).
- Woodhams, D. C., et al. Population trends associated with skin peptide defenses against chytridiomycosis in Australian frogs. Oecologia. 146 (4), 531-540 (2006).
- Woodhams, D. C., Voyles, J., Lips, K. R., Carey, C., Rollins-Smith, L. A. Predicted disease susceptibility in a Panamanian amphibian assemblage based on skin peptide defenses. Journal of Wildlife Diseases. 42 (2), 207-218 (2006).
- Woodhams, D. C., Rollins-Smith, L. A., Alford, R. A., Simon, M. A., Harris, R. N. Innate immune defenses of amphibian skin: antimicrobial peptides and more. Animal Conservation. 10, 425-428 (2007).
- Savage, A. E., Zamudio, K. R. MHC genotypes associate with resistance to a frog-killing fungus. PNAS. 108 (40), 16705-16710 (2011).
- Bataille, A., et al. Susceptibility of amphibians to chytridiomycosis is associated with MHC class II conformation. Proceeding of the Royal Society B. 282, 20143127 (2015).
- Fites, J. S., Reinert, L. K., Chappell, T. M., Rollins-Smith, L. A. Inhibition of local immune responses by the frog-killing fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Infection and Immunity. 82 (11), 4698-4706 (2014).
- Brannelly, L. A., Webb, R. J., Skerratt, L. F., Berger, L. Effects of chytridiomycosis on hematopoietic tissue in the spleen, kidney and bone marrow in three diverse amphibian species. Pathogens and Disease. 74 (7), ftw069 (2016).
- Brutyn, M., et al. Batrachochytrium dendrobatidis zoospore secretions rapidly disturb intercellular junctions in frog skin. Fungal Genetics and Biology. 49 (10), 830-837 (2012).
- Berger, L., Hyatt, A. D., Speare, R., Longcore, J. E. Life cycle stages of the amphibian chytrid Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 68 (1), 51-63 (2005).
- Pasmans, F., et al. Chytridiomycosis related mortality in a midwife toad (Alytes obstetricans) in Belgium. Vlaams Diergeneeskundig Tijdschrift. 79 (6), 460-462 (2010).
- Ellison, A. R., et al. More than skin deep: Functional genomic basis for resistance to amphibian chytridiomycosis. Genome Biology and Evolution. 7 (1), 286-298 (2014).
- Fites, J. S., et al. The invasive chytrid fungus of amphibians paralyzes lymphocyte responses. Science. 342 (6156), 366-369 (2013).
- Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death and Differentiation. 16 (8), 1093-1107 (2009).
- Kelly, K. J., Sandoval, R. M., Dunn, K. W., Molitoris, B. A., Dagher, P. C. A novel method to determine specificity and sensitivity of the TUNEL reaction in the quantitation of apoptosis. American Journal of Cell Physiology. 284 (5), C1309-C1318 (2003).
- Boyle, D. G., Boyle, D. B., Olsen, V., Morgan, J. A. T., Hyatt, A. D. Rapid quantitative detection of chytridiomycosis (Batrachochytrium dendrobatidis) in amphibian samples using real-time Taqman PCR assay. Diseases of Aquatic Organisms. 60 (2), 141-148 (2004).
- Brannelly, L. A., Webb, R., Skerratt, L. F., Berger, L. Amphibians with infectious disease increase their reproductive effort: evidence for the terminal investment hypothesis. Open Biology. 6 (6), 1-24 (2016).
- Webb, R., Mendez, D., Berger, L., Speare, R. Additional disinfectants effective against the amphibian chytrid fungus Batrachochytrium dendrobatidis. Diseases of Aquatic Organisms. 74 (1), 13-16 (2007).
- Woods, A., Ellis, R. . Laboratory Histopathology: A Complete Reference. , (1994).
- Brannelly, L. A., Roberts, A. A., Skerratt, L. F., Berger, L. Epidermal cell death in frogs with chytridiomycosis. PeerJ. 5, e2925 (2017).
