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Neuroscience

Isolement des capillaires cérébraux du tissu de cerveau humain frais

Published: September 12, 2018
doi:
10.3791/57346
, , , , , , , ,
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences,University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,University of Kentucky, 3Department of Neuroscience,University of Kentucky

Summary

Capillaires cérébraux isolés du tissu de cerveau humain peuvent servir comme un modèle préclinique pour étudier la fonction de barrière dans des conditions physiologiques et physiopathologiques. Nous présentons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain frais.

Abstract

Comprendre la fonction de barrière hémato – encéphalique dans des conditions physiologiques et physiopathologiques est essentielle pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques qui tiennent la promesse d’améliorer la livraison de drogue cerveau, améliorer la protection du cerveau et traiter le cerveau les troubles. Cependant, il est difficile d’étudier la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ainsi, il y a un besoin crucial pour les modèles appropriés. À cet égard, capillaires de cerveau isolés à partir des tissus cérébraux humains représentent un outil unique pour étudier la fonction de barrière comme proche de la situation humaine in vivo que possible. Nous décrivons ici un protocole optimisé pour isoler les capillaires du tissu de cerveau humain à un rendement élevé et avec une pureté et une qualité constante. Capillaires sont isolés du tissu de cerveau humain frais utilisant la filtration, centrifugation de gradient de densité et homogénéisation mécanique. Après l’isolement, les capillaires du cerveau humain peuvent être utilisés pour diverses applications, notamment les tests de fuite, l’imagerie de cellules vivantes et analyses immunitaire pour étudier l’expression des protéines et la fonction, l’activité enzymatique ou signalisation intracellulaire. Cerveau humain isolé capillaires sont un modèle unique d’élucider la régulation de la fonction de barrière hématoméningée humaine. Ce modèle peut donner un aperçu de la pathogenèse du système nerveux central (SNC), qui contribuera à l’élaboration de stratégies thérapeutiques pour le traitement des troubles du SNC.

Introduction

La barrière hémato – encéphalique est une interface étroitement contrôlée entre le sang et le cerveau qui détermine ce qui se passe dans et sort du cerveau. Anatomiquement, cellules endothéliales composent la barrière hémato – encéphalique et forment un réseau capillaire complexe et continu. Physiologiquement, ce réseau capillaire alimente le cerveau en oxygène et en nutriments tout en simultanément élimination du dioxyde de carbone et les déchets métaboliques. Ce qui est important, la preuve étaye que les modifications apportées à la barrière contribuent à nombreuses pathologies comme la maladie d’Alzheimer, l’épilepsie et AVC1,2,3,4,5 , 6 , 7. cerveau cellules endothéliales servent également un obstacle au traitement en bloquant l’absorption de drogues dans le cerveau, par exemple., chimiothérapie du glioblastome multiforme suite tumeur résection8,9, 10. À cet égard, les capillaires du cerveau humain isolé représentent un modèle de barrière hémato – encéphalique unique ex vivo qui ressemble étroitement à barrière propriétés in vivo, qui permet l’étude de la fonction de barrière et de dysfonctionnement en santé et la maladie. Dans cet article, nous fournissons un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du cerveau humain à une qualité constante capillaire et le rendement afin d’étudier la barrière hémato – encéphalique.

En 1969, Siakotos et al. 11 ont été le premier à signaler l’isolement des capillaires de cerveau du tissu de cerveau bovines et humaines utilisant la densité gradient centrifugation et verre perle colonne séparation. Plus tard, Goldstein et al. 12 ce procédé amélioré en ajoutant plusieurs étapes de filtration pour diminuer la quantité de tissu nécessaire pour étudier les capillaires de cerveau isolées de rats, tout en maintenant l’activité métabolique du transport du glucose. Depuis lors, les chercheurs optimisé la technique d’isolation capillaire maintes fois, amélioration du procédé et cerveau modèle capillaire avec chaque itération13,14,15. Par exemple, airelles et al. 16 isolé bovines capillaires à l’aide de la digestion enzymatique et non homogénéisation mécanique et puis par la suite passé une suspension capillaire à travers un filtre à tamis 210 µm et une colonne de perle de verre. Ces modifications amélioré la tache d’exclusion bleu trypan des capillaires cérébraux isolés et ainsi, augmenter la viabilité des cellules endothéliales. Dans les années 1990, Dallaire et al. 17 isolées des bovins et rat des capillaires qui étaient claires de contamination neuronale et maintient l’activité métabolique des γ-glutamyl transpeptidase (γ-GTase) et la phosphatase alcaline. En 2000, Miller et al. 18, utilisé isolé du rat et des capillaires de cerveau porcin en combinaison avec la microscopie confocale à montrer l’accumulation des substrats de transport dans la lumière des capillaires. Par la suite, notre laboratoire a continué d’optimiser la procédure d’isolement capillaire de cerveau et nous avons établi des essais de transport afin de déterminer la P-glycoprotéine (P-gp)19,20,21, le cancer du sein résistance à la protéine (BCRP)22,23et multirésistance protéine 2 (Mrp2) activité de transport de24 . En 2004, nous avons publié deux rapports où nous avons utilisé des capillaires de cerveau de rat isolé pour enquêter sur les différentes voies de signalisation. Hartz et al. 21, nous avons trouvé que le peptide de l’endothéline-1 rapidement et de façon réversible réduit fonction transport P-gp dans les capillaires de cerveau en agissant par l’intermédiaire du récepteur de l’endothéline récepteur B (ETB), l’oxyde nitrique synthase (NOS) et protéine kinase C (PKC). Dans Bauer et al. 19, nous avons démontré l’expression du récepteur récepteur nucléaire pregnane X (PXR) et montre PXR-modulation de la P-gp expression et transport fonction dans les capillaires du cerveau. Dans des expériences avec des souris transgéniques de PXR humanisés, nous avons élargi cette ligne de recherche et montré in vivo de serrage de la barrière de ses P-gp et hPXR activation25. En 2010, Hartz et al. 26 a utilisé cette méthode pour restaurer l’expression des protéines P-gp et transporter l’activité chez les souris de protéine (hAPP) précurseur de l’amyloïde humain transgénique qui surexpriment hAPP. En outre, rétablir la P-gp dans hAPP souris réduit significativement la bêta-amyloïde (Aß)40et taux bêta-amyloïdes dans le cerveau42.

En plus d’étudier les voies de signalisation, les capillaires cérébraux isolés peuvent être utilisés pour déterminer les changements dans la perméabilité capillaire que nous appelons une fuite capillaire. En particulier, le test de fuite de Texas Red est utilisé pour évaluer la fuite du colorant fluorescent Texas rouge de la lumière capillaire dans le temps et ces données sont ensuite utilisées pour analyser le taux de fuite. Les taux de fuite capillaire accrue par rapport à celles des capillaires de contrôle indiquent des changements dans l’intégrité physique de la barrière hémato – encéphalique2. C’est précieux parce qu’il y a de nombreux états pathologiques liés à la rupture de la barrière, par exemple., épilepsie, sclérose en plaques, la maladie d’Alzheimer et traumatisme cérébral lésion27,28,29, 30. Autres groupes ont également utilisé des capillaires isolées pour discerner les voies de signalisation qui régulent l’expression de la protéine et l’activité de transport des protéines31,32,33,34, 35,36,37. Enfin, nous avons continué à optimiser cette méthode pour l’isolement des capillaires du cerveau humain et, récemment, nous avons montré expression accrue de la P-gp à l’humaine barrière hémato – encéphalique chez les patients atteints d’épilepsie par rapport aux individus de témoin sans saisie38 . Pris ensemble, ces développements démontrent que les capillaires cérébraux isolés peuvent servir d’un modèle polyvalent pour étudier la fonction de barrière.

Divers in vivo, ex vivoet in vitro de barrière hémato – encéphalique modèles ont été utilisés en recherche fondamentale et de dépistage des drogues industrielle, principalement dans le but de tester des medicaments pour le cerveau39,,40,41 ,42,43,44. Outre isolés ex vivo le capillaires du cerveau, les modèles actuels de barrière hémato – encéphalique comprennent des modèles de in silico , in vitro culture cellulaire des cellules endothéliales des capillaires cérébraux isolés ou de lignées cellulaires immortalisées par divers espèces, la culture in vitro des cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) qui se différencient en cellules endothéliales capillaires du cerveau et des modèles sur une puce microfluidique.

In silico modèles sont plus couramment utilisés dans le développement de médicaments pour la sélection des candidats-médicaments basés sur prédite d’absorption, distribution, métabolisme et excrétion (ADME) Propriétés. Méthodes telles que les modèles de relation (QSPR) quantitative structure-propriété et quantitative structure-activité (RQSA) sont des méthodes populaires utilisés dans le criblage à haut débit des bibliothèques pour prédire la pénétration de cerveau de candidats-médicaments 45 , 46. ces modèles sont utiles aux molécules d’écran des propriétés de barrière de la pénétration.

Betz et al. 47 a créé monocouches de cellules endothéliales des capillaires cerveau cultivé comme un système de modèle in vitro barrière hémato – encéphalique. In vitro cell cultures de modèles à l’aide de tissu frais ou lignées de cellules endothéliales immortalisées comme les cellules endothéliales des microvaisseaux cérébrale humaine (hCMECs) peuvent être un autre outil de criblage à haut débit pour la pénétration du cerveau ou des études mécanistes. Cependant, les modèles de culture de cellules endothéliales capillaires cerveau n’ont pas la contrainte de cisaillement physiologique du débit sanguin à l’intérieur de la lumière capillaire, sont limitées à une complexité biologique dans l’ensemble et subissent des changements dans l’expression et la localisation des composants de la barrière importante comme les protéines des jonctions serrées, ion, les transporteurs, les enzymes et les récepteurs de surface de canaux48,49,50. À l’inverse, monocouches endothéliales dérivé de hPSCs, présenter une perméabilité de saccharose faible par rapport aux cultures hCMEC/D3 et contenir l’expression polarisée de certains transporteurs de barrière hémato – encéphalique, molécules d’adhérence et de jonctions serrées51, 52. Cependant, ces cellules sont également sous réserve de modification des propriétés dans la culture et le système doit être validé pour sa récapitulation de in vivo de propriétés de barrière52.

Nouvelles tendances dans la recherche de la barrière hémato – encéphalique incluent utilisant des systèmes de culture de tissu 3D pour créer artificielles capillaires, utilisant la technologie de l’orgue-on-chip pour générer des dispositifs microfluidiques, ou utilisant les fibres creuses technologie53, 54 , 55. les capillaires artificiels, cependant, ont significativement plus grands diamètres (100 – 200 µm) que des capillaires de cerveau (3 – 7 µm). Par conséquent, les forces de cisaillement l’in vitro ne ressemblent pas entièrement à la situation in vivo . Ceci est abordé dans la microfluidique « blood-brain-barrier-on-a-chip », où les membranes artificielles forme « sang » et le « cerveau » compartiments et fluides sont pompés grâce à ces dispositifs de génération de forces de cisaillement microfluidique. De même, des cultures de cellules endothéliales dans différentes combinaisons avec les astrocytes et les cellules musculaires lisses vasculaires ont également été utilisés avec la technologie de fibres creuses pour recréer les paramètres rhéologiques présents sous in vivo des conditions56 , 57 , 58. Toutefois, on ignore comment ce modèle reflète les autres propriétés de la barrière hémato – encéphalique, tels que le transport, le métabolisme, de signalisation et d’autres. Ces modèles capillaire et puce artificiels ne conviennent pas pour le criblage à haut débit des médicaments, mais les cellules utilisées pour générer ces modèles sont également sujettes à modification durant la culture.

Tranches de cerveau gelé et fixe ou cerveau primitif des cultures de cellules endothéliales capillaires sont des modèles supplémentaires qui peuvent être utilisé pourétudier la microcirculation humaine5,59,60,61. Par exemple, immunohistochimie des tissus cérébraux fixe est utilisée pour déterminer la localisation des protéines et expression en bonne santé par rapport aux tissus malades.

En plus de modèles in vitro et de tranches de tissus capillaires du cerveau décrit ci-dessus, fraîchement isolées peuvent être utilisés pour étudier la fonction de barrière hémato – encéphalique. Limites de ce modèle capillaire isolé comprennent la difficulté pour obtenir des tissus du cerveau humain frais, absence d’astrocytes et les neurones et un processus relativement long isolement. Un avantage du modèle capillaires cérébraux isolés est que ce modèle ressemble beaucoup à la situation in vivo et, par conséquent, peut être utilisé pour caractériser la dysfonction et la fonction de barrière. Ce qui est important, il peut être également utilisé de discerner les mécanismes de signalisation à l’aide d’une multitude de tests et techniques moléculaires3,19,62,63.

Notre laboratoire a accès à ces deux tissus de cerveau humain frais et surgelés à travers le centre de Sanders-Brown sur le vieillissement (CISR #B15-2602-M)64. Dans ce contexte, les autopsies suivent un protocole standard, les cerveaux est obtenus en < 4 h et toutes les procédures sont conformes aux NIH recueillis de pratiques recommandées,65. Compte tenu de cet accès unique aux tissus du cerveau humain, nous avons établi et optimisé un protocole visant à isoler les capillaires du cerveau du tissu de cerveau humain qui se traduit par un rendement élevé des capillaires de cerveau humain intact et viables. Deux points de terminaison communes d’intérêt sont à déterminer l’expression de la protéine et l’activité. À cet égard, nous et autres avons établi divers tests qui peuvent être utilisés avec les capillaires cérébraux isolés pour étudier l’expression des protéines et des niveaux d’activité. Ces essais incluent Éponger occidental, dosage Simple Western, immuno enzymatique (ELISA), chaîne par polymérase transcription inverse (RT-PCR), PCR quantitative (qPCR), zymographie, tests d’activité de transport, et essais de fuite capillaire. Ces tests permettent aux chercheurs d’étudier des changements en fonction de la barrière dans des conditions pathologiques humaines, déterminer les voies qui régissent l’activité et l’expression de la protéine et identifier les cibles pharmacologiques pour le traitement de la barrière hémato – encéphalique associé maladies.

Prises ensemble, fraîchement capillaires cérébraux isolés peuvent servir de modèle robuste et reproductible de la barrière hémato – encéphalique. Surtout, ce modèle peut être associé à plusieurs différents dosages pour déterminer un large éventail de points de terminaison pour étudier la fonction de barrière.

Protocol

Les informations ci-dessous repose sur la sécurité actuelle et des normes de réglementation à l’Université du Kentucky, Lexington, KY, é.-u.. Par mesure de précaution, se référer au programme de biosécurité de l’institution et les plus récents règlements et recommandations avant de travailler avec les tissus humains. ATTENTION : Le tissu humain peut être une source de pathogènes à diffusion hématogène, y compris le virus de l’immunodéficience humaine (VIH), virus de l…

Representative Results

L’isolement des tissus cérébraux humains produire une suspension enrichie dans des capillaires de cerveau humain (Figure 1 b) avec de petites quantités de gros navires, globules rouges, autres cellules individuelles et quelques débris cellulaires. Certains capillaires sont ramifiés, et, dans certains cas, les globules rouges sont pris au piège dans les lumières du capillaires. Le capillaire typique a un 3 – 7 µm de diamètre et est environ 100 à …

Discussion

Le présent protocole décrit l’isolement des capillaires de cerveau humain intact et viable de tissus frais. Dans cette section, nous discutons en détail de ce qui suit : 1) les modifications au protocole 2) dépannage des messages d’erreur, 3) les limites de la technique, 4) l’importance du modèle en ce qui concerne l’existant et des modèles alternatifs de barrière hémato – encéphalique, et 5). applications potentielles pour les capillaires du cerveau humain isolé.

Le protoco…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercier et remercier Dr Peter Nelson et Sonya Anderson à la Banque de tissus du cerveau UK-ADC permettant de cerveau humain tous les échantillons de tissus (numéro de licence de NIH : P30 AG028383 du National Institute on Aging). Nous remercions Matt Hazzard et Tom Dolan, Services informatiques, technologie universitaire et Engagement de faculté, Université du Kentucky pour assistance graphique. Ce projet a été soutenu par grant 1R01NS079507 numéro du National Institute of Neurological Disorders et accidents vasculaires cérébraux (à B.B.) et par grant 1R01AG039621 numéro du National Institute on Aging (à A.M.S.H).. Le contenu est la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les vues officielles de la National Institute of Neurological Disorders et accident vasculaire cérébral ou l’Institut National sur le vieillissement. Les auteurs déclarent sans intérêts financiers concurrents.

Materials

Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4°C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50mL Falcon tubes 25/rack – 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 ml syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 ml volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 ml volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 l Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 l Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 ml) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri Dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS – part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM
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Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).
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