JoVE Journal > Neuroscience
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Neuroscience

Yalıtım taze insan beyin dokusundan beyin kapiller

Published: September 12, 2018
doi:
10.3791/57346
, , , , , , , ,
1Sanders-Brown Center on Aging, Department of Pharmacology and Nutritional Sciences,University of Kentucky, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy,University of Kentucky, 3Department of Neuroscience,University of Kentucky

Summary

İnsan beyin dokusundan izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında çalışmaya preklinik model olarak kullanılabilir. Burada, beynin kılcal taze insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir iletişim kuralı mevcut.

Abstract

Anlayış kan – beyin bariyerini işlevi fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında beyin ilaç dağıtım geliştirmek için beyin korumasını geliştirmek ve beyin tedavi sözü tutun yeni tedavi stratejilerinin geliştirilmesi için önemlidir bozuklukları. Ancak, insan kan – beyin bariyerini işlev eğitim meydan okuyor. Böylece, uygun modelleri için kritik bir ihtiyaç vardır. Bu bağlamda, beyin kılcal insan beyin dokusundan izole bariyer fonksiyonu olarak insan vivo içinde durum mümkün olduğunca yakın çalışma için eşsiz bir araç temsil eder. Burada, kılcal bir yüksek verimli ve tutarlı kalite ve saflık insan beyin dokusundan izole etmek için en iyi duruma getirilmiş bir protokolü açıklar. Kılcal mekanik homojenizasyon, yoğunluğu-gradient Santrifüjü ve filtrasyon kullanma taze insan beyin dokusundan izole edilmiştir. Yalıtım sonra insan beyin kapiller protein ifade ve işlev, enzim aktivitesi veya hücre içi sinyal çalışmaya sızıntı deneyleri, canlı hücre görüntüleme ve bağışıklık tabanlı deneyleri gibi çeşitli uygulamalar için kullanılabilir. İzole insan beyin kılcal insan kan – beyin bariyerini işlevi Yönetmeliği aydınlatmak için benzersiz bir model vardır. Bu model CNS hastalıkları tedavisi için tedavi edici stratejiler geliştirilmesine yardımcı olacak merkezi sinir sistemi (MSS) patogenezinde kazandırabileceğini.

Introduction

Kan – beyin bariyerini kan ve ne gider ve beyin dışarı geliyor belirler beyin arasındaki sıkı şekilde denetlenen bir arabirimdir. Anatomik olarak, endotel hücreleri kan – beyin bariyerini oluşturmak ve karmaşık, sürekli kılcal ağ oluşturur. Fizyolojik açıdan, bu kılcal ağ aynı anda karbon dioksit ve metabolik atık ürünlerin atılması sırasında beyin oksijen ve besin sağlar. Önemlisi, kanıt bariyer değişikliklere Alzheimer hastalığı, epilepsi ve kontur1,2,3,4,5 de dahil olmak üzere çok sayıda patolojiler için katkıda destekler , 6 , 7. endotel hücreleri de hizmet tedavi için bir engel olarak beyne, Örneğinilaç alımı bloke ederek beyin., kemoterapi glioblastoma multiforme Tümör rezeksiyonu8,9, takip 10. Bu bağlamda, izole insan beyin kılcal damarlar çok bariyer fonksiyonu ve sağlıkta disfonksiyon eğitim veren bariyer özellikleri içinde vivo benzeyen bir benzersiz ex vivo kan – beyin bariyerini modeli temsil ve hastalık. Bu makalede, biz–dan sürekli yüksek kapiller kalitede insan beyin beyin kılcal yalıtmak ve kan – beyin bariyerini çalışmaya verim için bir protokol sağlar.

1969 yılında, Siakotos ve ark. 11 ilk beyin kapiller yoğunluk gradient Santrifüjü ve cam boncuk sütun ayrımı yöntemi kullanılarak sığır ve insan beyin dokusundan yalıtım rapor edildi. Daha sonra Goldstein vd. 12 bu yöntem doku sıçanlarından emir, glikoz taşıma metabolik aktivite koruyarak izole beyin kılcal çalışma için gerekli azaltmak için birden fazla filtrasyon adımları ekleyerek geliştirilmiş. O zamandan beri araştırmacılar çok kez, yöntemi ve beyin kapiller modeli her yineleme13,14,15ile iyileştirilmesi kapiller yalıtım yordamı optimize edilmiştir. Örneğin, Pardridge ve ark. 16 sığır kılcal mekanik homojenizasyon yerine enzimatik sindirim kullanarak izole ve sonra daha sonra 210 µm gözenekli filtre ve cam boncuk sütun kılcal bir süspansiyon geçti. Bu değişiklikler trypan mavi dışlama leke izole beyin kapiller geliştirilmiş ve böylece, endotel hücre canlılığı arttı. 1990’ların başında Dallaire ve ark. 17 nöronal kirlenme açıktı ve γ-glutamil transpeptidase (γ-GTase) ve alkalen fosfataz metabolik aktivite yapılmaktadır sığır ve sıçan kılcal izole. 2000’de, Miller ve ark. 18, izole sıçan ve domuz beyin kılcal confocal mikroskobu ile birlikte taşıma yüzeylerde birikimi kılcal lümen içine göstermek için kullanılır. Daha sonra bizim laboratuvar beyin kapiller yalıtım yordamı optimize etmek devam etmiştir ve P-glikoprotein (P-gp)19,20,21, meme kanseri belirlemek için taşıma deneyleri kurduk direnç protein (BCRP)22,23ve çoklu ilaç direnci protein 2 (Mrp2)24 taşıma etkinlik. 2004 yılında, biz nereye biz izole sıçan beyin kılcal çeşitli sinyal yolları araştırmak için kullanılan iki raporlar yayınlandı. Hartz ve ark. 21, peptid endotelin-1 P-gp taşıma işlevinde beyin kılcal (PKC) endotelin reseptör B (ETB) reseptör, nitrik oksit sentaz (NOS) ve protein kinaz C üzerinden hareket ederek hızla ve geri dönülebilir olarak azaltılmış bulduk. Bauer vd. 19, nükleer reseptör pregnane X reseptör (PXR) ifade ve P-gp ifade ve taşıma fonksiyonunu kullanabilirsiniz beyin kılcal gösterdi PXR modülasyon gösterdi. Deneylerde transgenik insanlaşmış PXR fareler ile bu satırı araştırma, genişletilmiş ve in vivo etkinleşmiş P-gp ile hPXR harekete geçirmek25tarafından bariyer sıkma gösterdi. 2010 yılında, Hartz ve ark. P-gp protein ifade geri yüklemek ve etkinlik mutlu overexpress transgenik insan amiloid precursor protein (mutlu) farelerde taşımak için bu yaklaşım 26 ‘ yı kullandık. Ayrıca, P-gp mutlu içinde geri fareler amiloid beta (Aβ)40ve Aβ42beyin düzeyleri azaltılacağını.

Sinyal yolları eğitim ek olarak, izole beyin kılcal biz kapiler kaçak başvuran kapiller permeabilite değişiklikleri belirlemek için kullanılabilir. Özellikle, Texas kırmızı sızıntı tahlil zaman ve bu veriler üzerinde kılcal lümen Texas kırmızıdan sonra kaçak oranları analiz etmek için kullanılan floresan boya kaçağı değerlendirmek için kullanılır. Bu denetim kılcal kıyasla artmış kapiller sızıntı kan – beyin bariyerini2fiziksel bütünlüğünü değişimler gösterir. Çok sayıda hastalık durumlarında bariyer bozulma, e.gile ilişkili olduğundan bu değerlidir., epilepsi, multipl skleroz, Alzheimer hastalığı ve travmatik beyin hasarı27,28,29, 30. Diğer grupları da protein ifade ve proteinler31,32,33,34taşıma faaliyetleri düzenleyen sinyal yolları ayırt etmek izole kılcal kullanılmıştır, 35,36,37. Son olarak, bu yöntem insan beyin kapiller yalıtım için optimize etmek devam etmiştir ve son zamanlarda, biz artan P-gp ifade insan kan – beyin bariyerini hastalarda, epilepsi nöbet ücretsiz kontrol bireylere38 karşılaştırıldığında ile gösterdi . Birlikte ele alındığında, bu gelişmeler izole beyin kılcal bariyer fonksiyonu eğitim için çok yönlü bir model olarak hizmet verebilir göstermektedir.

Çeşitli içinde vivo, ex vivove in vitro kan – beyin bariyerini modelleri temel araştırma ve endüstriyel uyuşturucu tarama, esas olarak ilaç dağıtım beyin39,40,41 test amacı ile kullanılmıştır ,42,43,44. İzole ex vivo beyin kılcal yanı sıra, geçerli kan – beyin bariyerini modelleri dahil silico modelleri, vitro hücre kültürü izole beyin kapiller endotel hücreleri veya çeşitli ölümsüzleştirdi hücre satırlarından türler, vitro kültür insan pluripotent kök beyin kapiller endotel hücreleri ve mikrosıvısal modelleri bir yonga üzerinde içine hücre (hPSC).

Silico modelleri tahmin edilen emme, dağıtım, metabolizması ve atılımı (ADME) özellikleri dayalı ilaç adaylarının seçmek için ilaç geliştirme içinde en yaygın olarak kullanılır. Niceliksel yapısı-özelliği ilişki (QSPR) modelleri ve niceliksel yapısı-etkinlik ilişkisi (QSAR) modelleri gibi yöntemleri kütüphanelerin yüksek üretilen iş tarama beyin penetrasyon ilaç adaylarının tahmin etmek için kullanılan popüler yöntem vardır 45 , 46. bu modeller ekran moleküllere bariyer penetrasyonu özellikleri için yararlıdır.

Betz vd. 47 monolayers kültürlü beyin kapiller endotel hücrelerinin bir vitro kan – beyin bariyerini modeli kurulmuş. Vitro hücre kültür modelleri taze doku veya ölümsüzleştirdi endotel hücre hatları gibi insan beyin microvessel endotel hücreleri (hCMECs) kullanarak beyin penetrasyon veya mekanik çalışmaları için başka bir yüksek üretilen iş tarama aracı olabilir. Ancak, beyin kapiller endotel hücre kültür modelleri fizyolojik kesme stres kan akımı kapiller lümen içinde eksikliği, genel olarak biyolojik karmaşıklığı sınırlıdır ve değişiklikleri ifade ve yerelleştirme önemli bariyer bileşenlerinin meydana sıkı kavşak proteinler gibi yüzey reseptörlerinin, ışınlayıcılar, enzimler ve iyon kanalları48,49,50. Diğer taraftan, endotel monolayers hPSCs türetilmiş, hCMEC/D3 kültürlere göre düşük sükroz geçirgenliği var ve bazı kan – beyin bariyerini taşıyıcılar, adezyon molekülleri ve sıkı kavşak51, polarize ifade içeren 52. ancak, bu hücreler aynı zamanda kültür özellikleri değiştirme tabi, ve sistem içinde vivo bariyer özellikleri52onun tekrarlama için doğrulanması gerekir.

Kan – beyin bariyerini araştırma daha yeni eğilimler mikrosıvısal cihazlar üretmek için organ-on-chip teknolojisini kullanarak veya içi boş fiber teknolojisi53, kullanan yapay kılcal damarlar, oluşturmak için 3D doku kültürü sistemleri kullanan dahil 54 , 55. yapay kılcal damarlar, ancak, önemli ölçüde daha büyük çaplarda (100 – 200 µm) beyin kılcal damarlar (3-7 µm) daha vardır. Bu nedenle, kesme kuvvetleri vitro değil tamamen benzer vivo içinde durum. Bu “blood-brain-barrier-on-a-chip” mikrosıvısal cihazlar, Yapay membran formu “kan” ve “beyin” bölmeleri ve sıvıları mikrosıvısal kesme kuvvetleri bu cihazlar aracılığıyla nerede pompalanır ele olduğunu. Benzer şekilde, astrocytes ile çeşitli kombinasyonlarda endotel hücreleri ve vasküler düz kas hücreleri ortak kültürleri de hollow fiber teknolojisi ile rheological parametreleri vivo içinde koşullar56 altında mevcut yeniden oluşturmak için kullanılmıştır , 57 , 58. ancak, ne kadar iyi bu modeli kan – beyin bariyerini taşıma, metabolizma, sinyal ve diğerleri gibi diğer özelliklerini yansıtır belli değildir. Bu yapay kılcal ve chip modelleri ilaçların yüksek üretilen iş tarama için uygundur, ancak bu modeller oluşturmak için kullanılan hücrelere de kültür sırasında değiştirilebilir.

Dondurulmuş ve sabit beyin dilimler veya birincil beyin kapiller endotel hücre kültürlerindeinsan microvasculature çalışma5,59,60,61için kullanılabilecek ek modellerdir. Örneğin, immünhistokimya sabit beyin dokusunun protein yerelleştirme belirlemek için kullanılır ve sağlıklı ifadede hastalıklı dokusu ile karşılaştırıldığında.

Dokusu dilimlerin ve vitro modelleri yanı sıra yukarıda açıklanan, taze izole beyin kılcal kan – beyin bariyerini işlev eğitim için yararlı olabilir. Bu izole kapiller modelin sınırlamaları içerir taze insan beyin dokusu, elde etmek için zorluk olmaması astrocytes ve nöronlar ve nispeten zaman alan ayırma işlemi. Bir avantajdır izole beyin kapiller modeli bu modeli çok benzeyen vivo içinde durum ve bu nedenle, bariyer fonksiyonu ve fonksiyon bozukluğu karakterize etmek için kullanılabilir. Önemlisi, bu da sinyal mekanizmalarını deneyleri ve moleküler teknikleri3,19,62,63çok sayıda kullanma ayırt için kullanılabilir.

Bizim Laboratuvar her iki taze ve donmuş insan beyin dokusu yaşlanma Sanders-kahverengi Merkezi aracılığıyla erişebilir (IRB #B15-2602-M)64. Bu bağlamda, standart bir protokol otopsi izle, beyin içinde elde edilen < 4 h ve tüm yordamları uygun NIH Biospecimen en iyi pratik kurallar65için. Bu benzersiz erişim insan beyin dokusu ile göz önüne alındığında, biz kurulan ve beyin kılcal sağlam, uygun insan beyin kılcal yüksek bir verim içinde sonuçları insan beyin dokusundan izole etmek için bir iletişim kuralı en iyi duruma getirilmiş. Protein ifade ve etkinliğini belirlemek için iki ortak bitiş noktası ilgi vardır. Bu bağlamda, biz ve diğerleri ile izole beyin kapiller protein ifade ve aktivite düzeyleri kullanılabilir çeşitli deneyleri kurduk. Bu deneyleri Western blot, basit Western tahlil, enzim bağlı immunosorbent assay (ELISA), Ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR), nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR), zymography, taşıma faaliyet deneyleri, içerir ve Kapiler kaçak deneyleri. Bu deneyleri araştırmacılar bariyer fonksiyonu insan patolojik koşullarında değişimler çalışma, protein ifade ve etkinlik düzenleyen yolları belirlemek ve kan – beyin bariyerini ilişkili tedavisi için farmakolojik hedefleri belirlemek izin hastalıklar.

Alınan birlikte, taze izole beyin kılcal kan – beyin bariyerini sağlam ve tekrarlanabilir model olarak hizmet verebilir. Özellikle, bu model bir yelpazeye bariyer fonksiyonu çalışma için bitiş noktaları belirlemek için birçok farklı deneyleri ile kombine edilebilir.

Protocol

Aşağıdaki bilgileri geçerli güvenlik ve Kentucky Üniversitesi, Lexington, KY, ABD düzenleyici standartlara dayanmaktadır. Bir güvenlik önlemi olarak, kurumun biyolojik güvenliği programı ve en güncel yönetmelik ve öneriler için insan dokusu ile çalışmaya başlamadan önce bakın. Dikkat: İnsan dokusu insan immün yetmezlik virüsü (HIV), Hepatit B virüsü (HBV), Hepatit C virüsü (HCV) ve diğerleri de dahil olmak üzere, kan yoluyla bulaşan patojenler bir kaynağı ol…

Representative Results

İnsan beyin dokusundan izolasyonların insan beyin kılcal (Şekil 1B) zenginleştirilmiş bir süspansiyon daha büyük gemiler, kırmızı kan hücreleri, diğer tek hücreleri ve bazı hücre artıkları küçük miktarlarda verim. Bazı kılcal dallı ve bazı, kırmızı kan hücreleri kılcal lümen entrapped. Tipik kılcal bir 3-7 µm çapı ve yaklaşık 100-200 µm uzun ile açık lümen; çoğu kapiller biter daraltılır. Confocal mikroskobu kulla…

Discussion

Mevcut protokolünü sağlam ve kalıcı insan beyin kapiller taze dokusundan yalıtım açıklar. Bu bölümde, biz aşağıda ayrıntılı olarak ele: 1) değişiklikleri protokolü, 2) yaygın hataları giderme, 3) Teknik sınırlamaları, 4) modeli ile ilgili mevcut ve alternatif kan – beyin bariyerini modelleri, önemi ve 5). izole insan beyin kılcal damarlar için potansiyel uygulamalar.

Burada açıklanan protokol 10 g taze insan frontal korteks doku için optimize edilmiştir. Ancak, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz teşekkür ederiz ve Dr Peter Nelson ve Sonya Anderson tüm insan beyin doku örnekleri sağlamak için UK-ADC beyin doku Bankası kabul (NIH izni numarası: P30 AG028383 yaşlanma Ulusal Enstitüsü). Matt Hazzard ve Tom Dolan, bilgi teknoloji hizmetleri, akademik teknoloji ve fakülte nişan, Kentucky Üniversitesi grafik yardım için teşekkür ederiz. Bu proje (BB için) hibe numara 1R01NS079507 sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur ve grant numara 1R01AG039621 yaşlanma Ulusal Enstitüsünden (için A.M.S.H.) tarafından desteklenmiştir. İçeriği yalnızca yazarlar sorumludur ve mutlaka sinir hastalıkları Ulusal Enstitüsü ve kontur veya Ulusal Enstitüsü resmi görüşlerini yaşlanma temsil etmiyor. Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarlarının bildirin.

Materials

Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium VWR, Radnor, PA, USA 32916-636 PPE
Disposable Protective Labcoats VWR, Radnor, PA, USA 470146-214 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 19460102 PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12 Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20" Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 14-206-32 to cover working areas
VWR Sharps Container Systems Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75800-272 for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz UK Supply Center, Lexington, KY, USA 323775
Equipment
4°C Refrigerator Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA AB15
Heidolph RZR 2102 Control Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA 501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 75004521
Leica L2 Dissecting Microscope Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer Kinematica AG, Luzern, Switzerland 9158168
Scale P-403 Denver Instrument, Bohemia, NY, USA 0191392
Standard mini Stir Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA 11-670-4C used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance OHAUS, Parsippany, NJ, USA VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5mL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377823T1 wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1000 µL Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21377821T1 resuspend pellet in BSA
Pipet Boy Integra, Hudson, NH, USA 739658
50mL Falcon tubes 25/rack – 500/cs VWR, Radnor, PA, USA 21008-951
EISCO Scalpel Blades Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA S95938C to mince brain tissue
PARAFILM VWR, Radnor, PA, USA 52858-000 to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA 21-377-304 to wash capillaries off filter
60 ml syringe with Luer-Lok Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA BD309653 used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 10060-13 used for mincing
Dumont Forceps #5 Fine Science Tools, Foster City, CA, USA 11251-10 used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA 3431E25 50 ml volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer VWR, Radnor PA USA 62400-642 15 ml volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm) Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA 146424 Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm) pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 43-50030-03
Connector Ring pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany 41-50000-03 reuse multiple time
1 l Volumetric Flask for preparation of Isolation Buffer
1 l Beaker for preparation of 1% BSA
Stir Bar for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 ml) for preparation of Ficoll®
Ice Bucket to keep everything cold
100 mm Petri Dish for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper VWR, Radnor, PA, USA 89260-222 to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA A9647-500g prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+ Hyclone SH30264.FS DPBS – part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400 Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA F4375 Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA G7528 Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA 71474 to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA P2256 Concentration: 1 mM
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Aronica, E., et al. Expression and cellular distribution of multidrug resistance-related proteins in the hippocampus of patients with mesial temporal lobe epilepsy. Epilepsia. 45 (5), 441-451 (2004).
  2. Hartz, A. M., et al. Amyloid-β contributes to blood-brain barrier leakage in transgenic human amyloid precursor protein mice and in humans with cerebral amyloid angiopathy. Stroke. 43 (2), 514-523 (2012).
  3. Hartz, A. M., et al. Aβ40 Reduces P-Glycoprotein at the Blood-Brain Barrier through the Ubiquitin-Proteasome Pathway. J Neurosci. 36 (6), 1930-1941 (2016).
  4. Kassner, A., Merali, Z. Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in Stroke. Stroke. 46 (11), 3310-3315 (2015).
  5. Lauritzen, F., et al. Monocarboxylate transporter 1 is deficient on microvessels in the human epileptogenic hippocampus. Neurobiol Dis. 41 (2), 577-584 (2011).
  6. Tishler, D. M., et al. MDR1 gene expression in brain of patients with medically intractable epilepsy. Epilepsia. 36 (1), 1-6 (1995).
  7. van Assema, D. M., et al. Blood-brain barrier P-glycoprotein function in Alzheimer’s disease. Brain. 135 (Pt 1), 181-189 (2012).
  8. Oberoi, R. K., et al. Strategies to improve delivery of anticancer drugs across the blood-brain barrier to treat glioblastoma. Neuro Oncol. 18 (1), 27-36 (2016).
  9. Parrish, K. E., et al. Efflux transporters at the blood-brain barrier limit delivery and efficacy of cyclin-dependent kinase 4/6 inhibitor palbociclib (PD-0332991) in an orthotopic brain tumor model. J Pharmacol Exp Ther. 355 (2), 264-271 (2015).
  10. Thomas, A. A., Brennan, C. W., DeAngelis, L. M., Omuro, A. M. Emerging therapies for glioblastoma. JAMA Neurol. 71 (11), 1437-1444 (2014).
  11. Siakotos, A. N., Rouser, G., Fleische, S. Isolation Of Highly Purified Human And Bovine Brain Endothelial Cells And Nuclei And Their Phospholipid Composition. Lipids. 4 (3), 234-239 (1969).
  12. Goldstein, G. W., Wolinsky, J. S., Csejtey, J., Diamond, I. ISOLATION OF METABOLICALLY ACTIVE CAPILLARIES FROM RAT-BRAIN. Journal of Neurochemistry. 25 (5), 715-717 (1975).
  13. Joo, F., Karnushina, I. A procedure for the isolation of capillaries from rat brain. Cytobios. 8 (29), 41-48 (1973).
  14. Joo, F., Rakonczay, Z., Wollemann, M. Camp-Mediated Regulation Of Permeability In Brain Capillaries. Experientia. 31 (5), 582-584 (1975).
  15. Panula, P., Joo, F., Rechardt, L. EVIDENCE FOR PRESENCE OF VIABLE ENDOTHELIAL CELLS IN CULTURES DERIVED FROM DISSOCIATED RAT-BRAIN. Experientia. 34 (1), 95-97 (1978).
  16. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid Sequestration And Degradation Of Somatostatin Analogs By Isolated Brain Microvessels. Journal of Neurochemistry. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  17. Dallaire, L., Tremblay, L., Beliveau, R. Purification And Characterization Of Metabolically Active Capillaries Of The Blood-Brain-Barrier. Biochemical Journal. 276, 745-752 (1991).
  18. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Molecular Pharmacology. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  19. Bauer, B., Hartz, A. M., Fricker, G., Miller, D. S. Pregnane X receptor up-regulation of P-glycoprotein expression and transport function at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 66 (3), 413-419 (2004).
  20. Bauer, B., Hartz, A. M., Miller, D. S. Tumor necrosis factor alpha and endothelin-1 increase P-glycoprotein expression and transport activity at the blood-brain barrier. Mol Pharmacol. 71 (3), 667-675 (2007).
  21. Hartz, A. M., Bauer, B., Fricker, G., Miller, D. S. Rapid regulation of P-glycoprotein at the blood-brain barrier by endothelin-1. Mol Pharmacol. 66 (3), 387-394 (2004).
  22. Hartz, A. M., Madole, E. K., Miller, D. S., Bauer, B. Estrogen receptor beta signaling through phosphatase and tensin homolog/phosphoinositide 3-kinase/Akt/glycogen synthase kinase 3 down-regulates blood-brain barrier breast cancer resistance protein. J Pharmacol Exp Ther. 334 (2), 467-476 (2010).
  23. Hartz, A. M., Mahringer, A., Miller, D. S., Bauer, B. 17-β-Estradiol: a powerful modulator of blood-brain barrier BCRP activity. J Cereb Blood Flow Metab. 30 (10), 1742-1755 (2010).
  24. Bauer, B., et al. Coordinated nuclear receptor regulation of the efflux transporter, Mrp2, and the phase-II metabolizing enzyme, GSTpi, at the blood-brain barrier. J Cereb Blood Flow Metab. 28 (6), 1222-1234 (2008).
  25. Bauer, B., et al. In vivo activation of human pregnane X receptor tightens the blood-brain barrier to methadone through P-glycoprotein up-regulation. Mol Pharmacol. 70 (4), 1212-1219 (2006).
  26. Hartz, A. M., Miller, D. S., Bauer, B. Restoring blood-brain barrier P-glycoprotein reduces brain amyloid-beta in a mouse model of Alzheimer’s disease. Mol Pharmacol. 77 (5), 715-723 (2010).
  27. Erickson, M. A., Banks, W. A. Blood-brain barrier dysfunction as a cause and consequence of Alzheimer’s disease. J Cereb Blood Flow Metab. 33 (10), 1500-1513 (2013).
  28. Marchi, N., et al. Consequences of repeated blood-brain barrier disruption in football players. PLoS One. 8 (3), e56805 (2013).
  29. Rempe, R. G., Hartz, A. M., Bauer, B. Matrix metalloproteinases in the brain and blood-brain barrier: Versatile breakers and makers. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (9), 1481-1507 (2016).
  30. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130, 521-534 (2007).
  31. Banks, W. A., et al. Tau Proteins Cross the Blood-Brain Barrier. J Alzheimers Dis. 55 (1), 411-419 (2017).
  32. Chan, G. N., et al. et al. In vivo induction of P-glycoprotein expression at the mouse blood-brain barrier: an intracerebral microdialysis study. J Neurochem. 127 (3), 342-352 (2013).
  33. Mesev, E. V., Miller, D. S., Cannon, R. E. Ceramide 1-Phosphate Increases P-Glycoprotein Transport Activity at the Blood-Brain Barrier via Prostaglandin E2 Signaling. Mol Pharmacol. 91 (4), 373-382 (2017).
  34. Ronaldson, P. T., Demarco, K. M., Sanchez-Covarrubias, L., Solinsky, C. M., Davis, T. P. Transforming growth factor-beta signaling alters substrate permeability and tight junction protein expression at the blood-brain barrier during inflammatory pain. J Cereb Blood Flow Metab. 29 (6), 1084-1098 (2009).
  35. Seelbach, M. J., Brooks, T. A., Egleton, R. D., Davis, T. P. Peripheral inflammatory hyperalgesia modulates morphine delivery to the brain: a role for P-glycoprotein. J Neurochem. 102 (5), 1677-1690 (2007).
  36. Sugiyama, D., et al. Functional characterization of rat brain-specific organic anion transporter (Oatp14) at the blood-brain barrier: high affinity transporter for thyroxine. J Biol Chem. 278 (44), 43489-43495 (2003).
  37. Wang, X., et al. Nrf2 upregulates ATP binding cassette transporter expression and activity at the blood-brain and blood-spinal cord barriers. J Neurosci. 34 (25), 8585-8593 (2014).
  38. Hartz, A. M., et al. P-gp Protein Expression and Transport Activity in Rodent Seizure Models and Human Epilepsy. Mol Pharm. 14 (4), 999-1011 (2017).
  39. Pardridge, W. M., Eisenberg, J., Yamada, T. Rapid sequestration and degradation of somatostatin analogues by isolated brain microvessels. J Neurochem. 44 (4), 1178-1184 (1985).
  40. Goldstein, G. W., Betz, A. L., Bowman, P. D. Use of isolated brain capillaries and cultured endothelial cells to study the blood-brain barrier. Fed Proc. 43 (2), 191-195 (1984).
  41. Pardridge, W. M., Triguero, D., Yang, J., Cancilla, P. A. Comparison of in vitro and in vivo models of drug transcytosis through the blood-brain barrier. J Pharmacol Exp Ther. 253 (2), 884-891 (1990).
  42. Audus, K. L., Bartel, R. L., Hidalgo, I. J., Borchardt, R. T. The use of cultured epithelial and endothelial cells for drug transport and metabolism studies. Pharm Res. 7 (5), 435-451 (1990).
  43. Abbott, N. J., Hughes, C. C., Revest, P. A., Greenwood, J. Development and characterisation of a rat brain capillary endothelial culture: towards an in vitro blood-brain barrier. J Cell Sci. 103 (Pt 1), 23-37 (1992).
  44. Miller, D. S., et al. Xenobiotic transport across isolated brain microvessels studied by confocal microscopy. Mol Pharmacol. 58 (6), 1357-1367 (2000).
  45. Dolgikh, E., et al. QSAR Model of Unbound Brain-to-Plasma Partition Coefficient, Kp,uu,brain: Incorporating P-glycoprotein Efflux as a Variable. J Chem Inf Model. 56 (11), 2225-2233 (2016).
  46. Narayanan, R., Gunturi, S. B. In silico ADME modelling: prediction models for blood-brain barrier permeation using a systematic variable selection method. Bioorg Med Chem. 13 (8), 3017-3028 (2005).
  47. Betz, A. L., Firth, J. A., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: distribution of enzymes between the luminal and antiluminal membranes of brain capillary endothelial cells. Brain Res. 192 (1), 17-28 (1980).
  48. Cucullo, L., Hossain, M., Puvenna, V., Marchi, N., Janigro, D. The role of shear stress in Blood-Brain Barrier endothelial physiology. BMC Neurosci. 12, 40 (2011).
  49. He, Y., Yao, Y., Tsirka, S. E., Cao, Y. Cell-culture models of the blood-brain barrier. Stroke. 45 (8), 2514-2526 (2014).
  50. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgård, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7 (5), e38149 (2012).
  51. Helms, H. C., et al. In vitro models of the blood-brain barrier: An overview of commonly used brain endothelial cell culture models and guidelines for their use. J Cereb Blood Flow Metab. 36 (5), 862-890 (2016).
  52. Stebbins, M. J., et al. Differentiation and characterization of human pluripotent stem cell-derived brain microvascular endothelial cells. Methods. 101, 93-102 (2016).
  53. Booth, R., Kim, H. Characterization of a microfluidic in vitro model of the blood-brain barrier (µBBB). Lab Chip. 12 (10), 1784-1792 (2012).
  54. Brown, J. A., et al. Recreating blood-brain barrier physiology and structure on chip: A novel neurovascular microfluidic bioreactor. Biomicrofluidics. 9 (5), 054124 (2015).
  55. Griep, L. M., et al. BBB on chip: microfluidic platform to mechanically and biochemically modulate blood-brain barrier function. Biomed Microdevices. 15 (1), 145-150 (2013).
  56. Cucullo, L., Hossain, M., Tierney, W., Janigro, D. A new dynamic in vitro modular capillaries-venules modular system: cerebrovascular physiology in a box. BMC Neurosci. 14, 18 (2013).
  57. Neuhaus, W., et al. A novel flow based hollow-fiber blood-brain barrier in vitro model with immortalised cell line PBMEC/C1-2. J Biotechnol. 125 (1), 127-141 (2006).
  58. Stanness, K. A., et al. A new model of the blood–brain barrier: co-culture of neuronal, endothelial and glial cells under dynamic conditions. Neuroreport. 10 (18), 3725-3731 (1999).
  59. Ghosh, C., et al. Pattern of P450 expression at the human blood-brain barrier: roles of epileptic condition and laminar flow. Epilepsia. 51 (8), 1408-1417 (2010).
  60. Jeynes, B., Provias, J. An investigation into the role of P-glycoprotein in Alzheimer’s disease lesion pathogenesis. Neurosci Lett. 487 (3), 389-393 (2011).
  61. Wijesuriya, H. C., Bullock, J. Y., Faull, R. L., Hladky, S. B., Barrand, M. A. ABC efflux transporters in brain vasculature of Alzheimer’s subjects. Brain Res. 1358, 228-238 (2010).
  62. Pekcec, A., et al. Targeting prostaglandin E2 EP1 receptors prevents seizure-associated P-glycoprotein up-regulation. J Pharmacol Exp Ther. 330 (3), 939-947 (2009).
  63. Zibell, G., et al. Prevention of seizure-induced up-regulation of endothelial P-glycoprotein by COX-2 inhibition. Neuropharmacology. 56 (5), 849-855 (2009).
  64. Nelson, P. T., et al. Clinicopathologic correlations in a large Alzheimer disease center autopsy cohort: neuritic plaques and neurofibrillary tangles "do count" when staging disease severity. J Neuropathol Exp Neurol. 66 (12), 1136-1146 (2007).
  65. Vaught, J., et al. The ISBER Best Practices: Insight from the Editors of the Third Edition. Biopreserv Biobank. 10 (2), 76-78 (2012).
  66. Gjedde, A., Kuwabara, H., Hakim, A. M. Reduction of functional capillary density in human brain after stroke. J Cereb Blood Flow Metab. 10 (3), 317-326 (1990).
  67. Karbowski, J. Scaling of brain metabolism and blood flow in relation to capillary and neural scaling. PLoS One. 6 (10), e26709 (2011).
  68. Lokkegaard, A., Nyengaard, J. R., West, M. J. Stereological estimates of number and length of capillaries in subdivisions of the human hippocampal region. Hippocampus. 11 (6), 726-740 (2001).
  69. Gerhart, D. Z., Broderius, M. A., Drewes, L. R. Cultured human and canine endothelial cells from brain microvessels. Brain Res Bull. 21 (5), 785-793 (1988).
  70. Tontsch, U., Bauer, H. C. ISOLATION, CHARACTERIZATION, AND LONG-TERM CULTIVATION OF PORCINE AND MURINE CEREBRAL CAPILLARY ENDOTHELIAL-CELLS. Microvascular Research. 37 (2), 148-161 (1989).
  71. Abbott, N. J. Dynamics of CNS barriers: Evolution, differentiation, and modulation. Cellular and Molecular Neurobiology. 25 (1), 5-23 (2005).
  72. Herculano-Houzel, S., Kaas, J. H., de Oliveira-Souza, R. Corticalization of motor control in humans is a consequence of brain scaling in primate evolution. J Comp Neurol. 524 (3), 448-455 (2016).
  73. Pardridge, W. M. Molecular biology of the blood-brain barrier. Mol Biotechnol. 30 (1), 57-70 (2005).
  74. Cirrito, J. R., et al. P-glycoprotein deficiency at the blood-brain barrier increases amyloid-beta deposition in an Alzheimer disease mouse model. J Clin Invest. 115 (11), 3285-3290 (2005).
  75. Rosenberg, G. A., Estrada, E. Y., Dencoff, J. E. Matrix metalloproteinases and TIMPs are associated with blood-brain barrier opening after reperfusion in rat brain. Stroke. 29 (10), 2189-2195 (1998).
  76. van Vliet, E. A., et al. Blood-brain barrier leakage may lead to progression of temporal lobe epilepsy. Brain. 130 (Pt 2), 521-534 (2007).
  77. Kermode, A. G., et al. Breakdown Of The Blood-Brain-Barrier Precedes Symptoms And Other Mri Signs Of New Lesions In Multiple-Sclerosis – Pathogenetic And Clinical Implications. Brain. 113, 1477-1489 (1990).
  78. Shlosberg, D., Benifla, M., Kaufer, D., Friedman, A. Blood-brain barrier breakdown as a therapeutic target in traumatic brain injury. Nat Rev Neurol. 6 (7), 393-403 (2010).
  79. Cecchelli, R., et al. Modelling of the blood-brain barrier in drug discovery and development. Nat Rev Drug Discov. 6 (8), 650-661 (2007).
  80. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiol Exp (Wars). 71 (1), 113-128 (2011).
  81. Hatherell, K., Couraud, P. O., Romero, I. A., Weksler, B., Pilkington, G. J. Development of a three-dimensional, all-human in vitro model of the blood-brain barrier using mono-, co-, and tri-cultivation Transwell models. J Neurosci Methods. 199 (2), 223-229 (2011).
  82. Rubin, L., et al. A cell culture model of the blood-brain barrier. The Journal of cell biology. 115 (6), 1725-1735 (1991).
  83. Gaillard, P. J., et al. Establishment and functional characterization of an in vitro model of the blood-brain barrier, comprising a co-culture of brain capillary endothelial cells and astrocytes. European journal of pharmaceutical sciences. 12 (3), 215-222 (2001).
  84. Nakagawa, S., et al. A new blood-brain barrier model using primary rat brain endothelial cells, pericytes and astrocytes. Neurochemistry international. 54 (3), 253-263 (2009).
  85. Li, J. Y., Boado, R. J., Pardridge, W. M. Blood-brain barrier genomics. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 61-68 (2001).
  86. Ott, M., Fricker, G., Bauer, B. Pregnane X receptor (PXR) regulates P-glycoprotein at the blood-brain barrier: functional similarities between pig and human PXR. J Pharmacol Exp Ther. 329 (1), 141-149 (2009).
  87. Méresse, S., Delbart, C., Fruchart, J. C., Cecchelli, R. Low-density lipoprotein receptor on endothelium of brain capillaries. Journal of neurochemistry. 53 (2), 340-345 (1989).
  88. Hartz, A. M., Bauer, B., Block, M. L., Hong, J. S., Miller, D. S. Diesel exhaust particles induce oxidative stress, proinflammatory signaling, and P-glycoprotein up-regulation at the blood-brain barrier. FASEB J. 22 (8), 2723-2733 (2008).
  89. Moser, K. V., Reindl, M., Blasig, I., Humpel, C. Brain capillary endothelial cells proliferate in response to NGF, express NGF receptors and secrete NGF after inflammation. Brain research. 1017 (1), 53-60 (2004).
  90. Carrano, A., et al. ATP-binding cassette transporters P-glycoprotein and breast cancer related protein are reduced in capillary cerebral amyloid angiopathy. Neurobiol Aging. 35 (3), 565-575 (2014).
  91. Deane, R., et al. RAGE mediates amyloid-beta peptide transport across the blood-brain barrier and accumulation in brain. Nat Med. 9 (7), 907-913 (2003).
  92. McCaffrey, G., et al. P-glycoprotein trafficking at the blood-brain barrier altered by peripheral inflammatory hyperalgesia. Journal of neurochemistry. 122 (5), 962-975 (2012).
  93. Sanchez del Pino, M. M., Hawkins, R. A., Peterson, D. R. Biochemical discrimination between luminal and abluminal enzyme and transport activities of the blood-brain barrier. J Biol Chem. 270 (25), 14907-14912 (1995).
  94. Agarwal, S., et al. Quantitative proteomics of transporter expression in brain capillary endothelial cells isolated from P-glycoprotein (P-gp), breast cancer resistance protein (Bcrp), and P-gp/Bcrp knockout mice. Drug metabolism and disposition. 40 (6), 1164-1169 (2012).
  95. Kamiie, J., et al. Quantitative atlas of membrane transporter proteins: development and application of a highly sensitive simultaneous LC/MS/MS method combined with novel in-silico peptide selection criteria. Pharmaceutical research. 25 (6), 1469-1483 (2008).
  96. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of neurochemistry. 117 (2), 333-345 (2011).
  97. Lee, B. -. C., Lee, T. -. H., Avraham, S., Avraham, H. K. Involvement of the Chemokine Receptor CXCR4 and Its Ligand Stromal Cell-Derived Factor 1α in Breast Cancer Cell Migration Through Human Brain Microvascular Endothelial Cells. Molecular Cancer Research. 2 (6), 327-338 (2004).
  98. Zagzag, D., et al. Hypoxia-inducible factor 1 and VEGF upregulate CXCR4 in glioblastoma: implications for angiogenesis and glioma cell invasion. Lab Invest. 86 (12), 1221-1232 (2006).
  99. Preston, J. E., Hipkiss, A. R., Himsworth, D. T. J., Romero, I. A., Abbott, J. N. Toxic effects of beta-amyloid(25-35) on immortalised rat brain endothelial cell: protection by carnosine, homocarnosine and beta-alanine. Neuroscience Letters. 242 (2), 105-108 (1998).

Tags

Cerebral CapillariesBlood-brain BarrierIsolationHomogenizationFicoll Density GradientFiltrationCentrifugation
check_url/57346?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Hartz, A. M., Schulz, J. A., Sokola, B. S., Edelmann, S. E., Shen, A. N., Rempe, R. G., Zhong, Y., Seblani, N. E., Bauer, B. Isolation of Cerebral Capillaries from Fresh Human Brain Tissue. J. Vis. Exp. (139), e57346, doi:10.3791/57346 (2018).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image