Isolering av Cerebral kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad

Summary

Isolerade hjärnan kapillärerna från mänsklig hjärnvävnad kan användas som en preklinisk modell för att studera barriärfunktion under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden. Här presenterar vi ett optimerat protokoll för att isolera hjärnan kapillärerna från färska mänsklig hjärnvävnad.

Abstract

Förståelse blod – hjärnbarriären funktion under fysiologiska och patofysiologiska förhållanden är avgörande för utvecklingen av nya terapeutiska strategier som håller löftet att förbättra hjärnan drug delivery, förbättra hjärnans skydd och behandla hjärnan störningar. Dock är att studera funktionen människors blod – hjärnbarriären utmanande. Således finns det en kritisk behovet av lämpliga modeller. I detta avseende representerar hjärnans kapillärer isolerade från mänsklig hjärnvävnad ett unikt verktyg för att studera barriärfunktion som nära mänskliga i vivo situationen som möjligt. Här beskriver vi ett optimerat protokoll för att isolera kapillärerna från mänsklig hjärnvävnad på en hög avkastning och med jämn kvalitet och renhet. Kapillärerna är isolerade från färska mänsklig hjärnvävnad med mekaniska homogenisering, täthetlutning centrifugering och filtrering. Efter isoleringen, kan mänskliga hjärnan kapillärerna användas för olika tillämpningar, inklusive läckage analyser, levande cell imaging och immun-baserade analyser för att studera proteinuttryck och funktion, enzymaktivitet eller Intracellulär signalering. Isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna är en unik modell för att belysa reglering av funktionen människors blod – hjärnbarriären. Denna modell kan ge insikter i centrala nervsystemet (CNS) patogenes, vilket kommer att bidra till utvecklingen av terapeutiska strategier för behandling av CNS-sjukdomar.

Introduction

På blod – hjärnbarriären är en väl kontrollerad gränssnitt mellan blod och hjärna som avgör vad går in och kommer ut ur hjärnan. Anatomiskt, endotelceller komponera på blod – hjärnbarriären och bildar ett komplex, kontinuerlig kapillär nätverk. Fysiologiskt, förser detta kapillära nätverk hjärnan med syre och näringsämnen medan samtidigt avyttra koldioxid och metabola restprodukter. Ännu viktigare, stöder bevis att barriären ändringarna bidra till många sjukdomar, däribland Alzheimers sjukdom, epilepsi och stroke^{1,2,3,4,5 , 6 , 7}. hjärnan endothelial celler också fungera som ett hinder för behandling genom att blockera drog upptag in i hjärnan, t.ex., kemoterapi av glioblastoma multiforme efter tumör resektion^{8,9, 10}. I detta hänseende isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna representerar en unik ex vivo blod – hjärnbarriären modell som liknar barriär boenden i vivo, vilket möjliggör studier av barriär-funktion och dysfunktion i hälsa och sjukdom. I denna artikel ger vi ett protokoll för att isolera hjärnan kapillärerna från mänskliga hjärnan på en konsekvent hög kapillär kvalitet och kapacitet för att studera på blod – hjärnbarriären.

1969, Siakotos et al. Det var först att rapportera isolering av hjärnan kapillärerna från bovin och human hjärnvävnad med täthet lutning centrifugering och glas pärla kolumn separation ¹¹ . Senare, Goldstein et al. ¹² förbättrades denna metod genom att lägga till flera filtrering steg för att minska mängden vävnad som behövs för att studera hjärnan kapillärerna isolerade från råtta, samtidigt som den metaboliska aktiviteten av glukos transporter. Sedan dess optimerad forskare kapillär isolering proceduren flera gånger, att förbättra metoden och hjärnan kapillär modellen med varje iteration^13,14,15. Exempelvis Pardridge et al. ¹⁶ isolerade nötkreatur kapillärer med enzymatisk nedbrytning i stället för mekanisk homogenisering, och sedan passerade senare en kapillär suspension genom en 210 µm mesh-filter och en glas pärla kolumn. Dessa modifieringar förbättrats trypan blå utslagning fläcken av isolerade hjärnan kapillärerna, och således ökade endotelceller livskraft. I början av 1990, Dallaire et al. ¹⁷ isolerade nötkreatur och råtta kapillärer som var klara för neuronal kontaminering och underhålls metabolisk aktivitet av γ-glutamyl transpeptidasen (γ-GTase) och alkaliskt fosfatas. I 2000, Miller et al. ¹⁸, används isolerade råtta och svin hjärnan kapillärerna i kombination med konfokalmikroskopi Visa ansamling av transport substrat i lumen av kapillärer. Därpå vårt laboratorium har fortsatt att optimera hjärnans kapillära isolering förfarandet och vi har etablerat transport analyser för att fastställa P-glykoprotein (P-gp)^19,20,21, bröstcancer Resistance protein (BCRP)^22,23, och flera läkemedelsresistens protein 2 (Mrp2)²⁴ transportverksamhet. I 2004 publicerat vi två rapporter där vi använt isolerade råtta hjärnan kapillärerna för att undersöka olika signalvägar. I Hartz et al. ²¹, vi fann att den peptid endotelin-1 snabbt och reversibelt reduceras P-gp transportfunktionen i hjärnans kapillärer genom att agera via endotelin B-receptorn (ET_B) receptor, kväveoxid syntas (NOS) och proteinkinas C (PKC). I Bauer m.fl. ¹⁹, vi visade uttrycket av nukleär receptor pregnane X receptorn (PXR) och visade PXR-modulering av P-gp uttryck och transport funktion i hjärnan kapillärerna. I experiment med transgena humaniserad PXR möss, vi utökat denna linje av forskning och visade i vivo skärpning av barriären av upregulating P-gp-hPXR aktiveringen²⁵. I 2010, Hartz et al. ²⁶ använde denna metod att återställa P-gp proteinuttryck och transportera aktivitet hos transgena mänskliga amyloid prekursor protein (hAPP) möss som överuttrycka hAPP. Dessutom minskade återställa P-gp i hAPP möss signifikant beta-amyloid (Aβ)₄₀och Aβ₄₂hjärnan nivåer.

Förutom att studera signalvägar, kan isolerade hjärnan kapillärerna användas för att fastställa förändringar i kapillär permeabilitet som vi kallar kapillär läckage. I synnerhet används Texas Red läckage analysen för att bedöma läckage av den fluorescerande färgämne Texas röd från kapillär lumen över tid och dessa uppgifter används sedan för att analysera läckage. Ökad kapillär läckage jämfört med de från kontroll kapillärer indikera förändringar i den fysiska integriteten av blod – hjärnbarriären². Detta är värdefullt eftersom det finns många sjukdomstillstånd associerade med barriär störningar, t.ex., epilepsi, multipel skleros, Alzheimers sjukdom och traumatiska hjärnan skada^{27,28,29, 30}. Andra grupper har också använt isolerade kapillärerna att urskilja signalvägar som reglerar proteinuttryck och transportverksamhet proteiner^{31,32,33,34, 35,36,37}. Slutligen har vi fortsatt att optimera denna metod för isolering av mänskliga hjärnan kapillärerna och, nyligen, visade vi ökat P-gp uttryck på den mänskliga blod – hjärnbarriären hos patienter med epilepsi jämfört med anfallsfria kontroll individer³⁸ . Sammantaget visar dessa utvecklingen att isolerade hjärnan kapillärerna kan tjäna som en mångsidig modell för att studera barriärfunktion.

Olika in vivo ex vivooch in vitro- blod – hjärnbarriären modeller har använts inom grundforskning och industriella drogkontroll, främst med målet att testa narkotika leverans till hjärnan^{39,40,41 ,42,43,44}. Förutom enstaka ex vivo hjärnan kapillärerna inkluderar nuvarande blod – hjärnbarriären modeller i silico modeller, in vitro- cellkultur för isolerade hjärnan kapillära endotelceller eller förevigade cellinjer från olika arter, i vitro kultur av mänskliga pluripotenta stamceller (hPSC) som differentieras till hjärnans kapillära endotelceller och mikroflödessystem modeller på ett chip.

I silico modeller är vanligast i läkemedelsutveckling för att välja läkemedelskandidater baserat på förväntade absorption, distribution, metabolism och utsöndring (ADME) egenskaper. Metoder såsom kvantitativa struktur-boendet relation (QSPR) modeller och modeller för kvantitativa struktur-aktivitetssamband (QSAR) är populära metoder används i high-throughput screening av bibliotek för att förutsäga hjärnan penetration av läkemedelskandidater ^{45 , 46}. dessa modeller är användbara för att skärmen molekyler för penetration barriäregenskaper.

Betz o.a. ⁴⁷ etablerat enskiktslager av odlade hjärnans kapillära endotelceller som en in vitro- blod – hjärnbarriären modellsystem. In vitro cell kultur modeller använder färsk vävnad eller förevigade endotelceller linjer såsom mänskliga cerebral microvessel endotelceller (hCMECs) kan vara en annan hög genomströmning screeningverktyg för hjärnan penetration eller mekanistiska studier. Men hjärnan kapillära endotelceller kultur modeller saknar fysiologiska skjuvspänningen av blodflödet inuti kapillär lumen är begränsade i övergripande biologiska komplexitet och genomgå förändringar i uttryck och lokalisering av hindret komponenter till exempel åtsittande föreningspunkt proteiner kanaler yta receptorer, transportörer, enzymer och ion^48,49,50. Omvänt, endothelial enskiktslager härrör från hPSCs, har låg sackaros permeabilitet jämfört med hCMEC/D3 kulturer och innehålla polariserade uttryck av några blod – hjärnbarriären transportörer, adhesionsmolekyler och åtsittande föreningspunkter^{51, 52}. dock dessa celler är också föremål för ändra egenskaper i kulturen, och systemet måste valideras för dess rekapitulation av i vivo barriär boenden⁵².

Nyare trender i blod – hjärnbarriären forskning inkluderar utnyttja 3D vävnadsodling system för att skapa konstgjorda kapillärer, använder den orgel-on-chip tekniken för att generera mikroflödessystem enheter, eller utnyttja den ihålig fiber teknik^{53, 54 , 55}. konstgjorda kapillärerna, men har betydligt större diametrar (100 – 200 µm) än hjärnan kapillärerna (3 – 7 µm). Därför liknar den skjuvning styrkor in vitro- inte helt i vivo situationen. Detta behandlas i ”blood-brain-barrier-on-a-chip” mikrofabricerade enheter, där konstgjorda membran form ”blod” och ”hjärnan” fack och vätskor pumpas genom dessa enheter generera mikroflödessystem skeva styrkor. Likaså har samtidig kulturer av endothelial celler i olika kombinationer med astrocyter och vaskulära glatta muskelceller också använts med ihålig fibertekniken för att återskapa reologiska parametrar närvarande enligt in-vivo -villkor-^{56 , 57 , 58}. det är dock oklart hur väl denna modell återspeglar andra egenskaper för den blood – brain barriären såsom transport, metabolism, signalering och andra. Dessa konstgjorda kapillär och chip modeller är lämpliga för high-throughput screening av droger, men de celler som används för att generera dessa modeller kan också ändras under kultur.

Frysta och fast hjärnan skivor eller primära hjärnans kapillära endotelceller kulturer finns ytterligare modeller som kan användas för attstudera den mänskliga mikrocirkulation^5,59,60,61. Till exempel immunohistokemi fast hjärnan vävnad används för att bestämma protein lokalisering och uttryck hos friska jämfört med sjuk vävnad.

Beskrivs ovan, nymalen isolerade hjärnan kapillärerna kan utnyttjas för att studera blod – hjärnbarriären funktion förutom vävnad skivor och in vitro- modeller. Begränsningar av denna isolerade kapillär modell är svårigheten att få färska mänsklig hjärnvävnad, avsaknad av astrocyter och nervceller, och en relativt tidskrävande isolering process. En fördel med isolerade hjärnan kapillär modellen är att denna modell liknar i vivo situationen och därför kan användas för att karaktärisera barriärfunktionen och dysfunktion. Ännu viktigare, kan det också användas att urskilja signalering mekanismer med hjälp av en mängd analyser och molekylärbiologiska metoder^3,19,62,63.

Vårt laboratorium har tillgång till både färsk och fryst mänsklig hjärnvävnad genom Sanders-brun centrum på åldrande (IRB nr B15-2602-M)⁶⁴. I detta sammanhang obduktioner följer ett standardprotokoll, hjärnor erhålls i < 4 h, och alla förfaranden överensstämmer med NIH Biospecimen riktlinjer för bästa praxis⁶⁵. Få detta unika tillgång till mänsklig hjärnvävnad, vi etablerade och optimerad ett protokoll för att isolera hjärnan kapillärerna från mänsklig hjärnvävnad som resulterar i en hög avkastning av intakt, livskraftiga mänskliga hjärnan kapillärerna. Två gemensamma slutpunkter av intresse är att bestämma proteinuttryck och aktivitet. I detta sammanhang har vi och andra etablerat olika analyser som kan användas med isolerade hjärnan kapillärerna för att studera proteinuttryck och aktivitetsnivåer. Dessa analyser omfatta Western blotting, enkel Western assay, enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), omvänd Transkription polymeras-kedjereaktion (RT-PCR), kvantitativa polymeras-kedjereaktion (qPCR), zymography, transport aktivitet analyser, och Kapillär läckage analyser. Dessa analyser tillåter forskare att studera förändringar i barriärfunktion i mänskliga patologiska förhållanden, bestämma vägar som reglerar proteinuttryck och aktivitet och identifiera farmakologiska mål för behandling av blod – hjärnbarriären är associerad sjukdomar.

Tas tillsammans, nymalen isolerade hjärnan kapillärerna kan fungera som en robust och reproducerbart modell av den blod – hjärnbarriären. Särskilt, kan denna modell kombineras med många olika analyser för att fastställa en rad olika slutpunkter att studera barriärfunktion.

Protocol

Informationen nedan är baserad på nuvarande säkerhetsstandarder och andra standarder vid University of Kentucky, Lexington, KY, USA. Som en säkerhetsåtgärd, se institutionens biologisk säkerhetsprogram och den mest aktuella regler och rekommendationer innan du arbetar med mänsklig vävnad. Varning: Mänsklig vävnad kan vara en källa till blodburna patogener, inklusive humant immunbristvirus (HIV), hepatit B-virus (HBV), hepatit C-virus (HCV) och andra. Arbeta med mänsklig vävnad ut…

Representative Results

Isoleringar från mänsklig hjärnvävnad ger en suspension berikad i mänskliga hjärnan kapillärerna (figur 1B) med små mängder av större fartyg, röda blodkroppar, andra enstaka celler och vissa cellfragment. Vissa kapillärer är Grenade, och, i vissa röda blodkroppar är anhållna i de kapillär lumina. Den typiska kapillären har en 3 – 7 µm diameter och är ca 100-200 µm lång med öppet lumen. de flesta kapillär ändarna döljs. Isolerade m?…

Discussion

Protokolls beskriver isolering av intakt och livskraftiga mänskliga hjärnan kapillärerna från färsk vävnad. I detta avsnitt diskuterar vi i detalj följande: 1) ändringar av protokollet, 2) Felsökning av vanliga fel, 3) begränsningar av tekniken, 4) betydelsen av modellen med avseende på befintliga och alternativa blod – hjärnbarriären modeller, och 5). potentiella tillämpningar för isolerade mänskliga hjärnan kapillärerna.

Protokollet beskrivs här är optimerad för 10 g fä…

Materials

Personal Protective Equipment (PPE)
Diamond Grip Plus Latex Gloves, Microflex Medium	VWR, Radnor, PA, USA	32916-636	PPE
Disposable Protective Labcoats	VWR, Radnor, PA, USA	470146-214	PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable lab coat is recommended
Face Shield, disposable	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	19460102	PPE; due to the nature of the human source material, the use of a disposable face shield is recommended
Safety Materials
Clavies High-Temperature Autoclave Bags 8X12	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	01-815-6
Versi Dry Bench Paper 18" x 20"	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	14-206-32	to cover working areas
VWR Sharps Container Systems	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	75800-272	for used scalpels
Bleach 8.2% Clorox Germicidal 64 oz	UK Supply Center, Lexington, KY, USA	323775
Equipment
4°C Refrigerator	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	13-986-148
Accume BASIC AB15 pH Meter	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	AB15
Heidolph RZR 2102 Control	Heidolph, Elk Grove Village, IL, USA	501-21024-01-3
Sorvall LEGEND XTR Centrifuge	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	75004521
Leica L2 Dissecting Microscope	Leica Microsystems Inc, Buffalo Grove IL, USA		used to remove meninges
POLYTRON PT2500 Homogenizer	Kinematica AG, Luzern, Switzerland	9158168
Scale P-403	Denver Instrument, Bohemia, NY, USA	0191392
Standard mini Stir	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	1151050
Thermo-Flasks Liquid Nitrogen Dewar	Thermal Scientific, Mansfiled, TX, USA	11-670-4C	used to freeze the tissue?
Voyager Pro Analytical Balance	OHAUS, Parsippany, NJ, USA	VP214CN
ZEISS Axiovert Microcope	Carl Zeiss, Inc Thornwood, NY, USA		used to check isolated capillaries
Tools and Glassware
Finnpipette II Pipette 1-5mL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21377823T1	wash capillaries off filter
Finnpipette II Pipette 100-1000 µL	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21377821T1	resuspend pellet in BSA
Pipet Boy	Integra, Hudson, NH, USA	739658
50mL Falcon tubes 25/rack – 500/cs	VWR, Radnor, PA, USA	21008-951
EISCO Scalpel Blades	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	S95938C	to mince brain tissue
PARAFILM	VWR, Radnor, PA, USA	52858-000	to cover beaker and volumetric flask
Thermo Scientific Finntip Pipet Tips 5 ml	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	21-377-304	to wash capillaries off filter
60 ml syringe with Luer-Lok	Thermo Fisher Scientific, Pittsburgh, PA, USA	BD309653	used with connector ring to filter capillaries
Scalpel Handle #4	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	10060-13	used for mincing
Dumont Forceps #5	Fine Science Tools, Foster City, CA, USA	11251-10	used to remove meninges
Potter-Elvehjem Tissue Grinder	Thomas Scientific, Swedesboro, NJ, USA	3431E25	50 ml volume, clearance: 150-230 μm
Dounce Homogenizer	VWR, Radnor PA USA	62400-642	15 ml volume, clearance: 80-130 μm
Spectra/Mesh Woven Filters (300 µm)	Spectrum Laboratories, Rancho Dominguez, CA, USA	146424	Used to filter capillary suspension to remove any meninges that may be left
pluriStrainers (pore size: 30 µm)	pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany	43-50030-03
Connector Ring	pluriSelect Life Science, Leipzig, Germany	41-50000-03	reuse multiple time
1 l Volumetric Flask			for preparation of Isolation Buffer
1 l Beaker			for preparation of 1% BSA
Stir Bar			for preparation of 1% BSA and Ficoll®
Schott Bottle (60 ml)			for preparation of Ficoll®
Ice Bucket			to keep everything cold
100 mm Petri Dish			for mincing of brain tissue
Tissue Culture Cell Scraper	VWR, Radnor, PA, USA	89260-222	to remove supernatant after centrifugation
Chemicals
BSA Fraction V, A-9647	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	A9647-500g	prepare in DPBS with Ca2+ & Mg2+ the day before. Avoid bubbles during preparation. Store in the refrigerator. Slowly stir for 10 min before use.
DPBS with Ca2+ & Mg2+	Hyclone	SH30264.FS	DPBS – part of the Isolation Buffer
Ficoll PM400	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	F4375	Exact measurement is important here. Weigh out in bottle with stir bar. Shake vigurously after adding DPBS. Keep in the fridge O/N. It will be clear in the morning. Stir gently for 10-15 min before use. Keep on ice until use.
Glucose (D-(+) Dextrose)	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	G7528	Glucose (D-(+) Dextrose) Concentration: 5 mM
Sodium Hydroxide Standard Solution	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	71474	to adjust pH of the DPBS
Sodium Pyruvate	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA	P2256	Concentration: 1 mM