Sporing Drosophila larve adfærd som svar på Optogenetic Stimulation af olfaktoriske neuroner
Summary
Denne protokol analyserer navigations opførsel af Drosophila larve i svar til samtidige optogenetic stimulation af dens olfaktoriske neuroner. Lys af 630 nm bølgelængde bruges til at aktivere individuelle olfaktoriske neuroner giver udtryk for en rød-skiftede kanal rhodopsin. Larve bevægelse spores samtidig, registreret digitalt og analyseret ved hjælp af brugerdefinerede-skrevet software.
Abstract
Insekter evne til at navigere mod lugt kilder er baseret på aktiviteterne i deres første-ordens olfaktoriske receptor neuroner (ORNs). Mens der har været en betydelig mængde af oplysninger vedrørende ORN svar til duftstoffer, forbliver rolle af specifikke ORNs i kørsel adfærdsmæssige reaktioner dårligt forstået. Komplikationer i adfærd analyser opstår på grund af forskellige volatiliteter af duftstoffer, der aktiverer individuelle ORNs, flere ORNs aktiveres af enkelt duftstoffer, og vanskelighederne ved at replikere naturligt observerede tidsmæssige variationer i olfaktoriske stimuli ved hjælp af konventionelle lugt-levering metoder i laboratoriet. Her, beskriver vi en protokol, der analyserer Drosophila larve adfærd som reaktion på samtidige optogenetic stimulation af dens ORNs. Optogenetic teknologi bruges her giver mulighed for specificitet af ORN aktivering og præcis styring af tidsmæssige mønstre af ORN aktivering. Tilsvarende larve bevægelse spores, registreret digitalt og analyseret ved hjælp af brugerdefinerede skrevet software. Ved at erstatte lugt stimuli med lys stimuli, giver denne metode mulighed for en mere præcis styring af individuelle ORN aktivering for at studere dens indvirkning på larve adfærd. Vores metode kunne forlænges yderligere for at studere virkningerne af anden ordens projektion neuroner (PNs) samt lokale neuroner (LNs) på larve adfærd. Denne metode vil dermed aktiverer en omfattende dissektion af olfaktoriske kredsløb funktion og supplere undersøgelser på hvordan olfaktoriske neuron aktiviteter oversætte i til opførsel svar.
Introduction
Olfaktoriske oplysninger i en Drosophila larve miljø er sanses af kun 21 funktionelt adskilte ORNs, aktiviteter som i sidste ende bestemme larve adfærd1,2,3,4. Dog er relativt lidt kendt om den logik, som sensorisk information er kodet i disse 21 ORNs aktiviteter. Der er således behov for at eksperimentelt måle de funktionelle bidrag af hver larve ORN til adfærd.
Selv om profilen sensoriske respons af hele repertoiret af Drosophila larve ORNs er blevet undersøgt i detaljer1,4,5, bidrag fra enkelte ORNs til olfaktoriske kredsløb og dermed til navigations funktionsmåde forbliver stort set ukendt. Hidtil, opstår vanskeligheder i larve adfærd undersøgelser, på grund af manglende evne til at rumligt og tidsligt aktivere enkelt ORNs. Et panel af duftstoffer, der specifikt aktiverer 19 af de 21 Drosophila larve ORNs blev for nylig beskrevet1. Hver enkelt lugtstof i panelet ved lave koncentrationer, fremkalder en fysiologisk reaktion fra dens beslægtet ORN. Men ved højere koncentrationer, der normalt anvendes til konventionelle adfærd assays, hver enkelt lugtstof fremkalder fysiologiske reaktioner fra flere ORNs1,5,6. Yderligere, duftstoffer i dette panel har varieret volatilitet, der komplicerer fortolkningen af adfærd undersøgelser, der afhænger af dannelsen af stabil lugt forløb7,8. Endelig, naturligt forekommende lugt stimuli har en tidsmæssig komponent, der er vanskelige at formere under laboratorieforhold. Det er derfor vigtigt at udvikle en metode, der kan måle larve adfærd mens samtidig aktivere individuelle ORNs rumlige og tidsmæssige.
Vi viser her, en metode, som har fordele i forhold til tidligere beskrevne larve tracking undersøgelser,1,8. Sporing af analysen beskrives i Gershow et al. bruger elektronisk styrede ventiler til at opretholde et stabilt forløb af lugt i adfærd arena8. Men på grund af niveauet for komplekst ingeniørarbejde involveret at bygge lugt stimulus setup, denne metode er vanskelige at formere sig i andre laboratorier. Yderligere uløste spørgsmål relateret til ved hjælp af Duftenes specifikt aktivere enkelt ORNs. Sporing analysen beskrives i Mathew et al. bruger en enklere lugt leveringssystem, men den resulterende lugt gradient er afhængige af test lugtstof volatilitet og er ustabil for lange varigheder af assay1. Således, ved at erstatte lugt stimuli med lys stimuli, vores metode har fordelene ved specificitet og præcis tidsmæssige kontrol af ORN aktivering og er ikke afhængige af dannelsen af lugt forløb af forskellige styrker.
Vores metode er nem at sætte og passer til forskere interesseret i at måle aspekter af Drosophila larve navigation. Denne teknik kunne tilpasses til andre modelsystemer, forudsat at forskeren er i stand til at køre udtryk for CsChrimson i deres favorit system neuron(s) valg. CsChrimson er en rød-forskudt version af kanal rhodopsin. Det er aktiveret på bølgelængder, der er usynlige for de larve phototaxis system. Vi er derfor at manipulere aktiviteten af neuroner med specificitet, pålidelighed og reproducerbarhed9. Ved at ændre den brugerdefinerede skrevet software for at tage hensyn til størrelse ændringer af emnerne, kunne denne metode let tilpasses til kravlende larver af andre insektarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Her, beskrevet vi en metode, der giver mulighed for måling af Drosophila larve adfærd som reaktion på samtidige optogenetic aktivering af olfaktoriske neuroner. Tidligere beskrevet larve tracking metoder1,8 bruger forskellige lugt levering teknologi hen til aktivere ORNs. Men disse metoder kan ikke kontrollere for specificitet eller tidsmæssige mønstre af ORN aktivering. Vores metode overvinder disse underskud ved hjælp af lys stimuli i stedet for …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af startup midler fra University of Nevada, Reno og ved NIGMS af National Institute of Health under grant nummer P20 GM103650.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
