Summary

Rastreamento do comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenética de neurônios olfativos

Published: March 21, 2018
doi:

Summary

Este protocolo analisa comportamento de navegação de larvas de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de seus neurônios olfativos. Luz de comprimento de onda de 630 nm é usada para ativar individuais neurônios olfativos expressando uma rodopsina canal avermelhado. Larval movimento simultaneamente é controlado digitalmente gravado e analisados utilizando o software personalizados.

Abstract

A capacidade de insetos para navegar em direção a fontes de odor baseia-se as atividades de seus neurônios olfactory do receptor de primeira ordem (ORNs). Gerou-se uma quantidade considerável de informações sobre ORN respostas a odorantes, o papel de ORNs específicas na condução de respostas comportamentais permanece mal compreendido. As complicações em análises de comportamento surgem devido a diferentes volatilidades dos odorantes que ativam ORNs individuais, vários ORNs ativados pelo único odorantes e da dificuldade em replicar naturalmente observadas variações temporais em estímulos olfactory usando métodos convencionais de odor-entrega no laboratório. Aqui, descrevemos um protocolo que analisa comportamento larval de Drosophila em resposta à estimulação optogenetic simultânea de suas ORNs. A tecnologia de optogenetic usada aqui permite a especificidade da ativação de ORN e controle preciso de padrões temporais de ativação ORN. Correspondente movimento larval é controlado digitalmente gravado e analisado usando personalizado escrito software. Substituindo a estímulos de odor com estímulos de luz, esse método permite que para um controle mais preciso da ativação de ORN individual a fim de estudar o seu impacto no comportamento larval. Nosso método para estudar o impacto de neurônios de projeção de segunda ordem (PNs) bem como neurônios locais (LNs) no comportamento larval poderia, ser novamente prorrogado. Este método permitirá, assim, uma dissecação completa da função olfativa circuito e complemento estudos sobre atividades de neurônio olfatório como traduzir em respostas de comportamento.

Introduction

Informação olfativa no ambiente da larva uma drosófila é detetada por apenas 21 ORNs funcionalmente distintos, as atividades de que, finalmente, determinar o comportamento larval1,2,3,4. No entanto, relativamente pouco é conhecido sobre a lógica pela qual informação sensorial é codificada nas atividades destas 21 ORNs. Assim, há uma necessidade de medir experimentalmente as contribuições funcionais de cada ORN larval de comportamento.

Embora o perfil de resposta sensorial do repertório inteiro de Drosophila ORNs larvas tem sido estudado em detalhe1,4,5, as contribuições de ORNs individuais para o circuito olfativo e, desse modo, para comportamento de navegação permanecem em grande parte desconhecidos. Em estudos de comportamento larval, até agora, dificuldades devido à incapacidade de espacial e temporalmente ativar ORNs único. Um painel de odores que ativam especificamente o 19. º as 21 ORNs larvas de Drosophila foi recentemente descrito1. Cada odorante no painel, em baixas concentrações, provoca uma resposta fisiológica apenas a partir de seu cognato ORN. No entanto, em altas concentrações que normalmente são usadas para os ensaios de comportamento convencional, cada odorant elicia respostas fisiológicas de múltiplos ORNs1,5,6. Além disso, odorantes neste painel têm variado volatilidades que complicam a interpretação dos estudos de comportamento que dependem de formação de odor estável gradientes7,8. Finalmente, naturalmente ocorrendo estímulos odor tem um componente temporal que é difícil de replicar em condições de laboratório. Portanto, é importante desenvolver um método que pode medir comportamento larval enquanto simultaneamente ativando ORNs individuais de uma forma espacial e temporal.

Aqui, vamos demonstrar um método que possui vantagens sobre rastreamento larval descrito anteriormente ensaios1,8. O ensaio de rastreamento descrito em Gershow et al usa válvulas eletronicamente controladas para manter um gradiente estável do odor no comportamento arena8. No entanto, devido ao nível de engenharia complexo envolvido para construir o odor estímulo de configuração, esse método é difícil de replicar em outros laboratórios. Além disso, os problemas relacionados ao uso de odorantes para ativar especificamente ORNs único continuam por resolver. O ensaio de rastreamento descrito na Mathew et al usa um sistema de entrega de odor mais simples, mas o gradiente de odor resultante depende da volatilidade do teste odorant e é instável para durações longas do ensaio1. Assim, substituindo a estímulos de odor com estímulos de luz, nosso método tem as vantagens da especificidade e um controle preciso da ativação de ORN temporal e não é dependente da formação de gradientes de odor de diferentes intensidades.

Nosso método é fácil de configurar e é apropriado para pesquisadores interessados em medir aspectos da navegação de larvas de Drosophila . Esta técnica poderia ser adaptada para outros sistemas modelo, desde que o pesquisador é capaz de dirigir a expressão de CsChrimson em neuron(s) seus favoritos do sistema de escolha. CsChrimson é uma versão avermelhado da rodopsina canal. Ele é ativado em comprimentos de onda que são invisíveis ao sistema de phototaxis da larva. Estamos, portanto, capazes de manipular a atividade de neurônios com especificidade, confiabilidade e reprodutibilidade9. Modificando o costume escrito software conta para alterações de tamanho dos indivíduos, esse método poderia ser facilmente adaptado para rastreamento larvas de outras espécies de insetos.

Protocol

1. construção de uma Arena de comportamento e preparação de Hardware para habilitar Optogenetic estimulação na Arena de comportamento Para construir uma arena de comportamento privado de luz, construir uma caixa com uma dimensão de 89 x 61 x 66 cm3 (L 35″ x 24″ W x 26″ H) feito de chapas de acrílico de acrílico colorido preto (espessura de 3 mm) (ver Tabela de materiais). Materiais para construir uma caixa tão grande devem estar disponíveis em lojas de ferragem locais. Col…

Representative Results

Para demonstrar a especificidade da ativação de ORN, nosso método foi aplicado com sucesso para determinar o impacto de duas diferentes ORN (ORN::7a & ORN::42a) ativação (ORNs expressando ou Or7a ou Or42a) sobre o comportamento de larva (Figura 3). Consistente com estudos recentes daquele indivíduo ORNs larvas são funcionalmente distintos1,10,13, nossos dados …

Discussion

Aqui, descrevemos um método que permite a medição do comportamento larval de Drosophila em resposta à ativação simultânea optogenetic dos neurônios olfativos. Descrito anteriormente larval de rastreamento métodos1,8 usar tecnologia de entrega de odor diferente para ativar ORNs. No entanto, esses métodos não podem controlar para a especificidade ou padrões temporais de ativação ORN. Nosso método supera esses défices usando estímulos de lu…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi financiado por fundos de inicialização da Universidade de Nevada, Reno e pelo NIGMS do Instituto Nacional de saúde, sob número de concessão GM103650 P20.

Materials

Video camera to capture larval movement
CCD Camera  Edmund Optics 106215
M52 to M55 Filter Thread Adapter Edmund Optics 59-446
2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses  Edmund Optics 59-445
RG-715, 2" Sq. Longpass Filter Edmund Optics 46-066
Electronics for optogenetic setup
Raspberry Pi 2B RASPBERRY-PI.org RPI2-MODB-V1.2
3 Channel programmable power supply newegg.com 9SIA3C62037092
8 Channel optocoupler relay amazon.com 6454319
630nm Quad-row LED strip lights environmentallights.com red3528-450-reel
850nm LED strips environmentallights.com wp-4000K-CC5050-60×2-kit
Software 
Matlab Mathworks Inc.
Ubuntu MATE v16.04 Nubuntu https://github.com/yslo/nubuntu
Other items
Plexiglass black acrylic Home Depot MC1184848bl
Fly food and other reagents
Nutrifly fly food Genesee Scientific 66-112
Agarose powder Genesee Scientific 20-102
22cm X 22cm square petri-dish VWR Inc. 25382-327
DMSO Sigma-Aldrich D2650
Sucrose Sigma-Aldrich 84097
All trans-retinal Sigma-Aldrich R2500
Flies
UAS-IVS-CsChrimson  Bloomington Drosophila Stock Center 55134
Orco-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 26818
Or42a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 9970
Or7a-Gal4 Bloomington Drosophila Stock Center 23907

References

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Cite This Article
Clark, D. A., Kohler, D., Mathis, A., Slankster, E., Kafle, S., Odell, S. R., Mathew, D. Tracking Drosophila Larval Behavior in Response to Optogenetic Stimulation of Olfactory Neurons. J. Vis. Exp. (133), e57353, doi:10.3791/57353 (2018).

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