초파리 애벌레 동작 Optogenetic 후 각 신경의 자극에 대 한 응답 추적
Summary
이 프로토콜 분석 초파리 애벌레 동시 optogenetic 그것의 후 각 신경의 자극에 대 한 응답에서의 탐색 동작 합니다. 630 nm 파장의 빛은 빨간색 이동 채널 rhodopsin 표현 개별 후 각 신경 세포를 활성화 하는 데 사용 됩니다. 애벌레의 움직임이 동시에 추적 하 고 디지털 기록, 사용자 작성 소프트웨어를 사용 하 여 분석.
Abstract
냄새 소스 쪽으로 이동 하는 곤충의 능력은 그들의 1 차 후 각 수용 체 신경 (ORNs)의 활동을 기반으로 합니다. Odorants 온 응답에 대 한 상당한 양의 정보를 생성 하는 동안 운전 행동 응답에 특정 ORNs의 역할 제대로 이해 남아 있습니다. 개별 ORNs, 여러 ORNs 단일 odorants, 그리고 어려움을 자연스럽 게 관찰된 시간적 변화 후 각 자극을 사용 하 여 복제에 의해 활성화 활성화 하는 odorants의 다른 volatilities 인해 발생 하는 동작 분석에 합병증 실험실에서 기존의 냄새 배달 방법입니다. 여기, 우리는 분석 초파리 애벌레 동작의 ORNs의 동시 optogenetic 자극에 응답에서 하는 프로토콜을 설명 합니다. 여기에 사용 된 optogenetic 기술 ORN 활성화의 특이성 ORN 활성화의 시간적 패턴의 정밀 하 게 제어 가능 합니다. 해당 애벌레 움직임 추적, 디지털 기록, 및 사용자 정의 작성 된 소프트웨어를 사용 하 여 분석. 가벼운 자극으로 냄새 자극을 대체 하 여이 메서드 애벌레 행동에 미치는 영향을 연구 하기 위해 개별 ORN 활성화 더 정밀 하 게 제어할 수 있습니다. 우리의 방법은 애벌레 행동에 로컬 뉴런 (LNs) 뿐만 아니라 2 차 프로젝션 뉴런 (PNs)의 영향을 공부 더 연장 될 수 있습니다. 이 방법은 따라서 후 각 회로 기능의 포괄적인 절 개 하면 그리고 어떻게 후 각 신경 활동에 대 한 보완 연구에 행동 반응 번역.
Introduction
초파리 애벌레의 환경에서 후 각 정보는 궁극적으로 애벌레 동작1,2,3,4결정만 21 기능적으로 뚜렷한 ORNs, 활동에 의해 감지입니다. 그러나, 상대적으로 작은 논리는 감각 정보를 인코딩하는이 21 ORNs의 활동에 대 한 알려져 있다. 따라서 실험적으로 측정 하는 동작을 각 애벌레 ORN의 기능적 기여 필요가 있다.
하지만 초파리 애벌레 ORNs의 전체 레 퍼 토리의 감각 응답 프로필 세부1,,45, 후 각 회로 하 고 그로 인하여 개별 ORNs의 기여에서에서 공부 하고있다 탐색 동작 크게 알려지지 않은 남아 있습니다. 애벌레 행동 연구에 어려움 공간 및 일시적으로 활성화 한 ORNs 하는 무 능력 때문에 지금까지 발생 한다. 특히 21 초파리 애벌레 ORNs의 19를 활성화 하는 odorants의 패널이 했다 최근 설명된1. 낮은 농도에서 패널에서 각 odorant 그것의 동족 온 에서만에서 생리 응답 elicits. 그러나, 기존의 행동 분석에 일반적으로 사용 되는 높은 농도에서 각 odorant 여러 ORNs1,,56생리 응답 elicits. 또한,이 패널에서 odorants volatilities 안정적인 냄새 그라디언트7,8의 형성에 의존 하는 행동 연구의 해석을 복잡 하 게 하는 다양 한 있다. 마지막으로, 자연스럽 게 발생 냄새 자극 실험실 조건 하에서 복제 하기 어려운 일시적인 구성 요소가 있다. 그것은 따라서 동시에 공간 및 시간적으로 개별 ORNs를 활성화 하는 동안 애벌레 동작을 측정할 수 있는 방법을 개발 하는 것이 중요.
여기, 우리는 앞에서 설명한 애벌레 추적 이점이 메서드 분석 실험1,8보여 줍니다. Gershow 외 에 설명 된 추적 분석 결과 동작 경기장8에서 냄새의 안정 그라디언트를 유지 하기 위해 전자 제어 밸브를 사용 합니다. 그러나, 냄새 자극 설정 구축에 관련 된 복잡 한 엔지니어링의 수준 때문에이 메서드는 다른 실험실에서 복제 어렵다. 또한, 특히 단일 ORNs를 활성화 하기 위해 odorants를 사용 하 여 관련 문제는 해결 되지 않은 남아 있습니다. 매튜 외 에 설명 된 추적 분석 결과 간단 하 게 냄새 배달 시스템을 사용 하지만 결과 냄새 그라데이션 테스트 odorant의 변동에 따라 달라 집니다1분석 결과 긴 기간에 대 한 안정적입니다. 따라서, 가벼운 자극으로 냄새 자극을 대체 하 여 우리의 방법은 특이성의 장점과 온 활성화의 정확한 시간 제어 하 고 다른 힘의 기온 변화도 냄새의 형성에 종속 되지 않습니다.
우리의 방법은 쉽게 설정 이며 연구자 초파리 애벌레 탐색의 측면을 측정 하는 데 관심이 대 한 적절 한입니다. 이 기술은 연구원은 드라이브 선택의 그들의 마음에 드는 시스템의 neuron(s)에서 CsChrimson 의 식 수는 다른 모델 시스템에 적응 될 수 있습니다. CsChrimson 채널 rhodopsin의 빨간색 이동 버전입니다. 그것은 애벌레의 phototaxis 시스템에 표시 되지 않는 파장에서 활성화 됩니다. 따라서 특이성, 안정성 및 재현성9뉴런의 활동을 조작할 수 있습니다. 계정 과목의 크기 변화에 대 한 소프트웨어를 작성 하는 사용자 정의 수정 하 여이 방법을 쉽게 다른 곤충 종의 크롤링 애벌레에 맞게 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기, 우리가 초파리 애벌레 동작 동시 optogenetic 후 각 뉴런의 활성화에 대 한 응답에서의 측정을 허용 하는 방법을 설명 합니다. 앞에서 설명한 방법1,를 추적 애벌레8 기술을 사용 하 여 다른 냄새 배달 ORNs를 활성화. 그러나, 이러한 방법은 특이성 또는 온 활성화의 시간적 패턴에 대해 제어할 수 없습니다. 우리의 방법은 온 활성화의 더 정밀 하 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 네바다, Reno의 대학에서에서 시작 자금 및 NIGMS 부여 번호 P20 GM103650 건강의 국립 연구소에 의해 지원 되었다.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
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