Spåra Drosophila Larval beteende som svar på Optogenetic stimulering av lukt nervceller
Summary
Detta protokoll analyserar navigeringsinstrument beteendet hos Drosophila larva i samtidiga optogenetic stimulering av dess lukt nervceller. Ljus av 630 nm våglängd används för att aktivera individuella lukt nervceller att uttrycka en röd-skiftat kanal rhodopsin. Larval rörelse spåras samtidigt, inspelade digitalt och analyseras med hjälp av anpassade skrivna programvara.
Abstract
Förmågan hos insekter att navigera mot lukt källor är baserad på deras första ordningens luktreceptor nervceller (ORNs) verksamhet. Medan en ansenlig mängd information har genererats angående ORN Svaren till odoranter roll specifika ORNs i körning beteendemässiga svaren är fortfarande dåligt förstådd. Komplikationer i beteende analyser uppstår på grund av olika volatiliteten av doftämnen som aktiverar enskilda ORNs, flera ORNs aktiveras av enda doftämnen, och svårigheten att replikera naturligt observerade tidsmässiga variationer i olfactory stimulans använda konventionella lukt-leverans metoder i laboratoriet. Här beskriver vi ett protokoll som analyserar Drosophila larval beteende som svar på samtidiga optogenetic stimulering av dess ORNs. Den optogenetic teknik som används här ger specificitet ORN aktivering och exakt kontroll av tidsmässiga mönster av ORN aktivering. Motsvarande larval rörelse spåras, inspelade digitalt och analyseras med anpassade skriftliga programvara. Genom att ersätta lukt stimuli med ljus stimuli, tillåter denna metod för en mer exakt kontroll av enskilda ORN aktivering för att studera dess inverkan på larval beteende. Vår metod kunde förlängas ytterligare för att studera effekterna av andra ordningens projektion nervceller (PNs) samt lokala nervceller (LNs) på larval beteende. Denna metod gör således en omfattande dissektion av lukt krets funktion och komplettera studier om hur luktsinnet neuron verksamhet översätta i beteende svar.
Introduction
Olfactory information i en Drosophila Larvs miljö registreras av endast 21 funktionellt distinkta ORNs, verksamhet som i slutändan bestämma larval beteende1,2,3,4. Men är relativt lite känt om den logik som är sensorisk information kodad i dessa 21 ORNs verksamhet. Därför finns det ett behov att experimentellt mäta funktionella bidragen från varje larval ORN till beteende.
Även om den sensoriska svar profilen av hela repertoaren av Drosophila larval ORNs har studerats i detalj1,4,5, bidrag från enskilda ORNs att luktsinnet kretsen och därmed navigeringsinstrument beteende fortfarande till stor del okända. I larval beteende studier hittills har svårigheter på grund av oförmågan att spatialt och temporalt aktivera enda ORNs. En panel av doftämnen som specifikt aktiverar 19 av de 21 Drosophila larval ORNs var nyligen beskriven1. Varje luktämnet i panelen, vid låga koncentrationer, framkallar en fysiologisk reaktion endast från dess cognate ORN. Emellertid, vid högre koncentrationer som normalt används för konventionella beteende analyser, framkallar varje luktämnet fysiologiska reaktioner från flera ORNs1,5,6. Ytterligare, doftämnen i den här panelen har varierat volatiliteten som komplicerar tolkningen av beteende studier som beror på bildandet av stabil lukt övertoningar7,8. Slutligen, naturligt förekommande lukt stimuli har en tidsmässig komponent som är svår att replikera under laboratorieförhållanden. Det är därför viktigt att utveckla en metod som kan mäta larval beteende medan samtidigt aktivera enskilda ORNs i rumsliga och tidsmässiga sätt.
Här visar vi en metod som har fördelar jämfört med tidigare beskrivna larval spårning analyser1,8. Spårning analysen beskrivs i Gershow et al. använder elektroniskt styrda ventiler för att upprätthålla en stabil gradient av lukt i beteende arena8. På grund av den komplexa engineering inblandade att bygga lukt stimulans setup, är denna metod dock svårt att replikera i andra laboratorier. Ytterligare, de frågor relaterade till att använda odoranter specifikt aktivera enda ORNs förblir olösta. Spårning analysen beskrivs i Mathew et al. använder ett enklare lukt leveranssystem, men den resulterande lukt lutningen är beroende av volatiliteten i test luktämnen och är instabil för långa löptider av test1. Således, genom att ersätta lukt stimuli med ljus stimuli, vår metod har fördelarna med specificitet och temporal precisionskontroll av ORN aktivering och är inte beroende av bildandet av lukt lutningar av olika styrkor.
Vår metod är lätt att ställa in och är lämpligt för forskare som är intresserade av att mäta aspekter av Drosophila larval navigering. Denna teknik kan anpassas till andra modellsystem förutsatt att forskaren kunna köra uttrycket av CsChrimson i deras favorit systemets neuron(s) val. CsChrimson är en röd-skiftat version av kanal rhodopsin. Det aktiveras vid våglängder som är osynliga för Larvens phototaxis system. Vi har därför möjlighet att manipulera aktiviteten hos nervceller med specificitet, pålitlighet och reproducerbarhet9. Genom att ändra den anpassade skriftliga programvara för storleksändringar av betvingar, kunde denna metod enkelt anpassas för krypande larver av andra insektsarter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här, beskrivit vi en metod som möjliggör för mätning av Drosophila larval beteende som svar till samtidiga optogenetic aktivering av lukt nervceller. Tidigare beskrivits larval spårning metoder1,8 använder olika lukt leverans teknik för att aktivera ORNs. Dock kan inte dessa metoder styra för antingen specificitet eller tidsmässiga mönster av ORN aktivering. Vår metod övervinner dessa underskott med ljus stimuli i stället för lukt stimuli …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete var stöds av start medel från vid University of Nevada, Reno och NIGMS av National Institute of Health under licensnummer P20 GM103650.
Materials
| Video camera to capture larval movement | |||
| CCD Camera | Edmund Optics | 106215 | |
| M52 to M55 Filter Thread Adapter | Edmund Optics | 59-446 | |
| 2" Square Threaded Filter Holder for Imaging Lenses | Edmund Optics | 59-445 | |
| RG-715, 2" Sq. Longpass Filter | Edmund Optics | 46-066 | |
| Electronics for optogenetic setup | |||
| Raspberry Pi 2B | RASPBERRY-PI.org | RPI2-MODB-V1.2 | |
| 3 Channel programmable power supply | newegg.com | 9SIA3C62037092 | |
| 8 Channel optocoupler relay | amazon.com | 6454319 | |
| 630nm Quad-row LED strip lights | environmentallights.com | red3528-450-reel | |
| 850nm LED strips | environmentallights.com | wp-4000K-CC5050-60×2-kit | |
| Software | |||
| Matlab | Mathworks Inc. | ||
| Ubuntu MATE v16.04 | Nubuntu | https://github.com/yslo/nubuntu | |
| Other items | |||
| Plexiglass black acrylic | Home Depot | MC1184848bl | |
| Fly food and other reagents | |||
| Nutrifly fly food | Genesee Scientific | 66-112 | |
| Agarose powder | Genesee Scientific | 20-102 | |
| 22cm X 22cm square petri-dish | VWR Inc. | 25382-327 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | |
| All trans-retinal | Sigma-Aldrich | R2500 | |
| Flies | |||
| UAS-IVS-CsChrimson | Bloomington Drosophila Stock Center | 55134 | |
| Orco-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 26818 | |
| Or42a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 9970 | |
| Or7a-Gal4 | Bloomington Drosophila Stock Center | 23907 |
References
- Mathew, D., et al. Functional diversity among sensory receptors in a Drosophila olfactory circuit. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 2134-2143 (2013).
- Ramaekers, A., et al. Glomerular maps without cellular redundancy at successive levels of the Drosophila larval olfactory circuit. Current biology : CB. 15, 982-992 (2005).
- Couto, A., Alenius, M., Dickson, B. Molecular, anatomical, and functional organization of the Drosophila olfactory system. Current biology : CB. 15, 1535-1547 (2005).
- Kreher, S. A., Kwon, J. Y., Carlson, J. R. The molecular basis of odor coding in the Drosophila larva. Neuron. 46, 445-456 (2005).
- Kreher, S. A., Mathew, D., Kim, J., Carlson, J. R. Translation of sensory input into behavioral output via an olfactory system. Neuron. 59, 110-124 (2008).
- Hallem, E. A., Carlson, J. R. Coding of odors by a receptor repertoire. Cell. 125, 143-160 (2006).
- Monte, P., et al. Characterization of the larval olfactory response in Drosophila and its genetic basis. Behav Genet. 19, 267-283 (1989).
- Gershow, M., et al. Controlling airborne cues to study small animal navigation. Nature methods. 9, 290-296 (2012).
- Klapoetke, N. C., et al. Independent optical excitation of distinct neural populations. Nature methods. 11, 338-346 (2014).
- Hernandez-Nunez, L., et al. Reverse-correlation analysis of navigation dynamics in Drosophila larva using optogenetics. eLife. 4, (2015).
- Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118, 401-415 (1993).
- Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature methods. 10, 64-67 (2013).
- Newquist, G., Novenschi, A., Kohler, D., Mathew, D. Differential contributions of Olfactory Receptor Neurons in a Drosophila olfactory circuit. eNeuro. 3, (2016).
- Schulze, A., et al. Dynamical feature extraction at the sensory periphery guides chemotaxis. eLife. 4, (2015).
- Tastekin, I., et al. Role of the Subesophageal Zone in Sensorimotor Control of Orientation in Drosophila Larva. Current Biology. 25, 1448-1460 (2015).
- Famiglietti, E. V., Kolb, H. Structural basis for ON-and OFF-center responses in retinal ganglion cells. Science. 194, 193-195 (1976).
- Luo, L., et al. Bidirectional thermotaxis in Caenorhabditis elegans is mediated by distinct sensorimotor strategies driven by the AFD thermosensory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, 2776-2781 (2014).
- Berck, M. E., et al. The wiring diagram of a glomerular olfactory system. eLife. 5, (2016).
