Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

Konstruere Thioether/Vinyl sulfid-tøjret spiralformet peptider Via foto-induceret Thiol-fje/yne Hydrothiolation

Published: August 1, 2018 doi: 10.3791/57356
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology, Peking University Shenzhen Graduate School
* These authors contributed equally

Summary

Vi præsenterer en protokol til opførelse af thioether/vinyl sulfid-tøjret spiralformet peptider ved hjælp af foto-induceret thiol-fje/thiol-yne hydrothiolation.

Abstract

Her beskriver vi en detaljeret protokol for forberedelse af thioether-bundet peptider ved hjælp af på harpiks intramolekylære/intermolekylære thiol-en hydrothiolation. Derudover beskriver denne protokol forberedelse af vinyl-sulfid-tøjret peptider ved hjælp af i-løsning intramolekylære thiol-yne hydrothiolation mellem amino acids, der besidder Alken/alkyn sidekæder og cystein restkoncentrationer ved jeg, jeg + 4 positioner. Lineær peptider blev syntetiseret ved hjælp af en standard Fmoc-baserede faststadie syntese (SPP'ER). Thiol-en hydrothiolation udføres ved hjælp af enten en intramolekylære thio-en reaktion eller en intermolekylære thio-en reaktion, afhængigt af peptid længde. I denne forskning udføres en intramolekylære thio-en reaktion i tilfælde af kortere peptider ved hjælp af på harpiks deprotection af trityl grupperne af cystein rester efter komplet syntesen af den lineære peptid. Harpiks er derefter sat til UV-bestråling ved hjælp af photoinitiator 4-methoxyacetophenone (kort) og 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). De intermolekylære thiol-fje reaktionen udføres ved at opløse Fmoc-Cys-OH i et N, N- dimethylformamid (DMF) opløsningsmiddel. Dette er derefter reagerede med peptid ved hjælp af Alken-bærende rester på harpiks. Ovenpå udføres macrolactamization ved hjælp af benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) og 4-Methylmorpholine (NMM) som aktivering reagenser på harpiks. Efter macrolactamization, faststadie peptidsyntese er fortsat ved hjælp af standard SPP'ER. I forbindelse med thio-yne hydrothiolation, er den lineære peptid kløvet fra harpiks, tørret og derefter opløst i afgassede DMF. Dette er derefter bestrålet med UV-lys med photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Efter reaktionen, DMF er fordampet og den rå rest er fældet og renset ved hjælp af high-performance væskekromatografi (HPLC). Disse metoder kan fungere for at forenkle generation af thioether-bundet cyklisk peptider fra anvendelse af thio-fje/yne Klik kemien, der besidder overlegne funktionsgruppe tolerance og godt udbytte. Indførelsen af thioether obligationer i peptider udnytter naturens nukleofil af cystein restkoncentrationer og er redox-inaktivt i forhold til disulfid obligationer.

Introduction

Udviklingen af ligander til at modulere protein-protein interaktioner (ppi) giver en attraktiv tilgang til moderne drug discovery. Således, en stor indsats er blevet investeret i at studere roman kemiske metoder, der effektivt kan modulere PPI1,2,3. Producentprisindeks består som regel af lavvandede, store og/eller udgåede interagerende overflader, og små molekyler er typisk anset for at være uegnet ligander til graduering af PPI4,5. Med en egnet udsatte interagerende overflade område repræsenterer kort peptider, der efterligner de strukturelle egenskaber af protein grænseflader ideelle kandidater til at løse dette problem6,7. Korte peptider er dog typisk ustruktureret i en vandig opløsning. Dette er at vandmolekyler, der konkurrerer med intramolekylære brint limning netværk af peptid rygraden og veldefinerede konformationer er entropically ugunstige i vand8. Derudover peptider i sagens natur lav stabilitet og permeabilitet celleegenskaber i høj grad begrænse deres brug i biologisk programmer9,10. Ifølge protein data bank (FBF) analyse, > 50% af PPI omfatter korte α-helix interaktioner11. Således er forskellige kemiske metoder blevet udviklet med hensyn til helix stabilisering. Disse omfatter disulfid/thioether bond dannelse12,13,14, ring-lukning metathesis15, lactam ring dannelse16, "Klik" kemi17, tilsætning af perfluoroarenes18,19, og vinyl-sulfid dannelse20.

Stabiliseret spiralformet peptider udnyttes bredt for forskellige intracellulære mål, herunder p53, østrogen receptorer, Ras, BCL-2 familie proteiner, og andre21,22,23,24. ALRN-6924, en all-kulbrinte hæftet peptid dual hæmmer af MDM2 og MDMX, der aktuelt anvendes for kliniske undersøgelse25. I de sidste par år, har vores gruppe fokuseret på udviklingen af roman peptid stabilisering metoder ved hjælp af thiol-fje og thiol-yne reaktioner26,27,28. I almindelighed, viste vi, at disse foto-initierede reaktioner er effektiv milde betingelser, når naturligvis rigelige cystein er brugt. Derudover har vi vist at disse reaktioner har en fremragende funktionsgruppe tolerance, er bio-ortogonale, og har vist sig for at være gældende for peptid og protein ændringer29. De resulterende thioether/vinyl sulfid tøjret peptider i høj grad forbedre den kemiske plads af constraint peptider, give en labile på tether ændring center og er bevist for at være gældende for anvendelser i mange biologiske ansøgninger30 ,31,32. Til dato, er blevet beskrevet kun begrænset rapporter vedrørende thiol-fje/thiol-yne peptid cyclization. I en undersøgelse offentliggjort af Anseth et al. i 2009, var en på harpiks intramolekylære thiol-en reaktion for peptid cyclization mellem aktiveret alkener med cystein demonstreret33. I 2015, Chou mfl. beskrevet en to-komponent radikal indviede thiol-en reaktion for peptid hæftning34 og en efterfølgende, sekventiel thiol-yne/en kobling reaktion35. Vi beskrev for nylig, en serie af arbejde baseret på thioether/vinyl sulfid tøjret peptider20,26,27. Denne protokol beskriver en detaljeret syntese af ovennævnte thioether/vinyl sulfid tøjret peptider i håb om at det vil være nyttigt for det bredere forskersamfundet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. udstyr forberedelse

  1. Apparatet manuelle peptid-syntese placere et vakuum manifold (Table of Materials) i et effektivt stinkskab. Dernæst sted trevejsspærreventiler på vakuum manifold og forbinde dem til en nitrogen eller argon gas linje. Cap alle ubrugte fjorde bruger gummi septa.
  2. Tilslut harpiks-fyldte kolonner (0,8 x 4 cm, 10 mL reservoir, se Tabel af materialer) til manifold bruger trevejsspærreventiler (figur 1). Bruge en pumpe, tilsluttet et vakuum system som vakuum filtrering eller en gummi pipette pære ved ekstrudering for at fjerne opløsningsmidlet i kolonnerne.
  3. Brug en photoreactor (figur 2), udstyret med ti 350 nm lamper (Table of Materials) til UV-bestråling. Forbinde disse til en argon gastank via photoreactor luftindtaget til at sikre, at photoreactor er fyldt med argon gas forud for og under photoreactions.
  4. Før du skifter på UV lampe af photoreactor, sikre at photoreactor døren er lukket i tilfælde af bestråling fra UV-lys.

2. harpiks forberedelse

Bemærk: I almindelighed, opførelsen af peptid substrater er udført ved hjælp af Fmoc-baseret faststadie syntese protokoller. Disse er foretaget, ved hjælp af rink akrylamid harpiks, der efterlader en C-terminale akrylamid resterende følgende peptid kavalergang. Denne protokol bruges i hele papiret.

Forsigtig: N, N- dimethylformamid (DMF), dichlormethan (DCM), 4-methylmorpholine (NMM) og N, N- diisoproylethylamine (DIPEA) er giftige og farlig ved indånding, indtagelse eller hudkontakt. Diethylether er meget brandfarligt. Trifluoreddikesyre (TFA) er ætsende. 1,2-ethanedithiol (EDT) er meget ildelugtende. Alle organiske opløsningsmidler og kemikalier bør derfor behandles med passende personlige værnemidler (nitrilhandsker, laboratoriekittel og beskyttende briller) og håndteret inde en kemisk stinkskab.

  1. Beregning af harpiks kræves ved hjælp af følgende formel:
    skalere (mmol) / (harpiks læsning kapacitet (mmol/g) 1.000 (mg/g)) = masse af harpiks (mg)
    F.eks., mængden af rink akrylamid MBHA harpiks (0,5 mmol/g) for 25 µmol = 0,025 mmol / (0,5 mmol/g 1.000 mg/g) = 50 mg. Næste, vejer 50 mg af harpiks i en kolonne og sætte det op på den vakuum manifold bruger trevejsspærreventiler.
  2. Tilføje 1-2 mL af DCM til harpiks i en kolonne (0,8 x 4 cm, 10 mL reservoir). Til at svulme harpiks, forsigtigt agitere det ved hjælp af en nitrogen eller argon stream i 10 min. Næste, fjerne ved hjælp af vakuum filtrering af opløsningsmiddel.

3. N-terminale Fmoc Deprotection og vask

  1. Forberede den N-terminale Fmoc deprotecting løsning: forberede et passende volumen (200 mL) i 50% (v/v) morpholin i DMF i en glasflaske.
  2. Tilføje 1-2 mL af opløsningen, deprotection til harpiks, forsigtigt gnub det i 10 min og derefter dræne løsning ved hjælp af et vakuum. Brug af DMF (1-2 mL) og DCM (1-2 mL) i rækkefølgen, vaske harpiks og reaktion fartøj grundigt for i alt 3 x. Næste, Gentag procedurerne for deprotection og vask 1 x.

4. Fmoc-beskyttet aminosyre kobling

  1. Med kobling i alanin rester som eksempel, for en 25 µmol-skala manuel syntese, vejer Fmoc-Ala-OH (5-ækvivalent, 41,4 mg), 2-(6-chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate (HCTU; 4,9-ækvivalent, 50,5 mg) i en polypropylen container og opløses i DMF (0,5 mL).
  2. Tilføje DIPEA (10-ækvivalent, 43,5 µl) for at generere en 0,25-M aktiveret aminosyre løsning (tabel 1). Efter en omtrentlig 1 min pre-aktivisering, tilføje løsningen til harpiks, og derefter boble det med N2 for ca 1-2 h.
  3. Fra dette trin på indarbejde hver aminosyre i peptid kæden som en sekvens af trin: først deprotection af den N-terminale Fmoc-gruppe, og derefter vask, efterfulgt af kobling af aminosyren via aktivering ved hjælp af HCTU.
    Bemærk: En længere kobling tid (fx., 2 h) anbefales hvis kobling efter sterically hindres aminosyre rester [fx., Fmoc-Thr (tBu) - ÅH, Fmoc-Cys (Trt) - ÅH, Fmoc, hans (Trt) - ÅH, Fmoc-Arg (Pbf) - OH]. Alken/alkyn forsynet med un-naturlige aminosyrer er brugt i 3 ækvivalenter i stedet for 5 og er overladt til at reagere til 3 h.
  4. Overvåge peptid syntese fremskridt ved hjælp af Kaiser eller chloranil test, som beskrevet af Arora et al. 36 disse afprøvninger giver kvalitative vurderinger af tilstedeværelse eller fravær af gratis primære og sekundære aminer. Alternativt kan ca. 2-3 mg peptid kløvet fra harpiks og analyseret af LC-MS.

5. thiol-en Hydrothiolation og Thiol-yne Cyclization

  1. Konstruere thioether linker gennem-harpiks cyclization (figur 3).
    1. Forberede ca. 50 mL Trt deprotection løsning (TFA/TIS/DCM 0.03/0.06/1.0). Behandle Cys- og mS5-forsynet med harpiks [NH2-R-mS5-A-A-A-Cys (Trt)-R'-resin, 50 mg] med 1-2 mL af Trt deprotection løsning i en 10 mL kolonne. Forsigtigt agitere løsning i 10 min. ved hjælp af N2. Endelig, vaske det med DCM (1-2 mL) for i alt 3 x.
      Bemærk: MS5 repræsenterer alkylene-bærende byggesten (Se strukturen afbildet i figur 6) bruges for peptid kobling og thio-en cyclization38.
    2. Gentag fremgangsmåden ovenfor for en samlet beløb på ca 6 x for at fjerne gruppen trityl beskyttelse af cystein, indtil løsningen farve ikke længere er gul.
    3. Boblede med Nielsen2, vaske R-mS5- A-A-A-Cys(-SH)-R'-harpiks [cystein med gratis thio (-SH)] med DMF (1-2 mL) og DCM (1-2 mL) i nævnte rækkefølge. Skrumpe harpiks bruger methanol (1-2 mL) for 2 min og derefter fjerne ved hjælp af filtrering af opløsningsmiddel. Næste, sekventielt tørre harpiks under en damp af N2 gas til ca. 5 min. i kolonnen.
    4. Forberede afgassede DMF på forhånd, inden for en mund kolbe, af boblende nitrogen gas for ca. 1 h gennem en lang nål, der var strakt i opløsningsmidlet.
    5. Ionbyttermaterialet overføres til en 10-mL rundbundet kolbe gennem vejer papir. Suspendere harpiks i 2 mL af den afgassede DMF efterfulgt af tilsætning af photoinitiator 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP; 1 ækvivalent, 5,6 mg), 4-methoxyacetophenone (kort; 1 ækvivalent, 3,8 mg).
    6. Tilføje opsigt bar (0,3 cm) i kolben og cap kolben med en egnet gummiproppen, så fortrænge luften i kolben med nitrogen gas ved hjælp af en oliepumpe.
      Bemærk: Den inert atmosfære er ikke strengt nødvendigt for effektiv thio-en photoreaction på en fast fase. Men det er meget nødvendigt for thio-yne photoreaction i løsning fase i figur 5. Ellers, svovl vil oxidere under UV-bestråling.
    7. Sat i reaktionskolben i photoreactor og rør resin til 1 h under UV-bestråling ved stuetemperatur (figur 2).
      Forsigtig: Før tændes photoreactor UV-lampe, sikre, at photoreactor døren er lukket i tilfælde af skadelig bestråling fra UV-lys.
      Bemærk: Ofte prøveudtagning reaktionsmiljøet under photoreactions anbefales til nye sekvenser, som den lineære peptid forløber har identiske molekylvægt af produktet. Generelt er vise lineære og cyklisk peptider markant forskellige hydrofiliciteten. Dette kan let adskilles ved hjælp af HPLC. Alternativt, 5, 5' - dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) (DTNB) reagens kan også bruges til at studere tilstedeværelsen af gratis thiol37.
    8. Ionbyttermaterialet overføres fra kolben til kolonnen og fjerne opløsningsmiddel ved hjælp af vakuum filtrering. Vask og tør harpiks, som beskrevet i trin 5.1.3.
    9. Forberede ca. 10 mL kløvningen cocktail (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) i stinkskab.
    10. Ionbyttermaterialet overføres til en 2-mL polypropylen beholder, tilsættes 1 mL af kavalergang cocktail (TFA/TIPS/EDT/H2O 94/1/2.5/2.5) til container og forsegle beholderen tæt ved hjælp af et skruelåg. Derefter forsigtigt agitere container på en orbitalryster med en sats på 60 rpm i stinkskab til 1,5-2 h.
      Forsigtig: TFA er stærkt ætsende. Bær beskyttende tøj og arbejde i et effektivt stinkskab. EDT er en stærkt ildelugtende stof og skal håndteres i et effektivt stinkskab.
    11. Fjerne TFA cocktail af fordampning under en N2 gasstrøm i stinkskab. Næste, udfældes restkoncentrationer ved hjælp af kold diethylether (1 mL) for 30 s og isolere det via centrifugering ved 12.000 x g i 2 min. Efter centrifugering, hæld forsigtigt komponenten ether. Gentag trinene bundfald og centrifugering for 2 x. Fordampe rester til tørhed.
    12. Endelig Remanensen opløses i 1 mL H2O/acetonitril (2:1) og rense ved HPLC ved hjælp af et analytisk C18 kolonne (4.6 x 250 mm, hastighed 1,0 mL/min). Brug H2O (som indeholder 0,1% TFA) og ren acetonitril som opløsningsmiddel i en 2%/min lineær gradient fra 20% til 70% acetonitril over 25 min. skærm HPLC spectra ved hjælp af UV-280 nm og 220 nm bølgelængder (tabel 2).
  2. Konstruere thioether linker gennem intermolekylære thio-en reaktion, og derefter cyclize peptid af macrolactamization (figur 4).
    1. Syntetisere den alkylene rest forsynet med lineær peptid H2N-A-A-A-mS5(2-R'')-R'-harpiks (50 mg) ved hjælp af standard Fmoc-baserede faststadie syntese (SPP'ER) som beskrevet i trin 2-4. Næste, vaske og tørre harpiks, som beskrevet i trin 5.1.3.
    2. Suspendere harpiks i en 10 mL rundbundet kolbe, som indeholder 2 mL af den afgassede DMF, som beskrevet i trin 5.1.4.
    3. Tilføj photoinitiator MMP og kort (MMP: 1 ækvivalent, 5,6 mg; KORT: 1 ækvivalent, 3,8 mg), Fmoc-Cys-OH (3-ækvivalent, 25,7 mg), og røre bar (0,3 cm) i kolben. Cap kolben ved hjælp af en egnet gummiproppen og derefter bruge oliepumpe til at udskifte luften i kolben med kvælstof.
    4. Sat i reaktionskolben i photoreactor. Rør i 1-2 h under UV-bestråling ved stuetemperatur (figur 2).
    5. Overvåge reaktion under en LC-MS analyse: kløver 2-3 mg af harpiks ved hjælp af kavalergang cocktail. Derefter udfælde resten med kolde diethylether (300 µL), isolere resten af centrifugering og fordampe rester til tørhed, som beskrevet i trin 5.1.11. Efter at Remanensen opløses i 100 µL af H2O/acetonitril (2:1). Filtratet peptid løsning ved hjælp af et 0,22 µm Mikroporøs folie og analysere det ved hjælp af LC-MS med sammensatte ioniseret i electrospray Ionisation (ESI) og drives i positiv tilstand.
    6. Hvis nødvendigt, gentage trin 5.2.2 - er 5.2.4 at sikre, at reaktionen udført til færdiggørelse.
    7. Efter afslutningen af foto-reaktion, Ionbyttermaterialet overføres fra kolben til kolonnen, og fjern ved hjælp af vakuum filtrering af opløsningsmiddel. Vask og tør harpiks, som beskrevet i trin 5.1.3.
    8. Tilføje DMF løsning af benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBob; 2,4-ækvivalent, 31,2 mg), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt; 2,4-ækvivalent, 8,1 mg), og NMM (4-ækvivalent, 11 µL) til harpiks, i kolonnen for macrolactamization. Boble denne løsning med N2 for 2 h.
      1. Desuden overvåge denne kobling reaktion ved hjælp af LC-MS, som beskrevet i trin 5.2.3. Gentag dette trin for at sikre, at reaktionen udføres til afslutning, om nødvendigt.
    9. Aflang peptid ved hjælp af standard Fmoc-baserede SPP'ER som beskrevet i trin 3 og 4.
    10. Ved samling af alle aminosyrerester, spaltes peptid fra harpiks, som beskrevet i trin 5.1.10 og 5.1.11 og rense det som beskrevet i trin 5.1.12.
  3. Konstruere vinyl sulfid linker i løsning fase (figur 5).
    1. Syntetisere alkyn rester forsynet med lineær peptid ved hjælp af standard Fmoc-baserede SPP'ER som beskrevet i trin 2-4. Syntetisere alkyn forsynet med aminosyren efter en veletableret protokol, som beskrevet i en tidligere undersøgelse20.
    2. Kløver peptid fra harpiks og udfælde den ved hjælp af kold diethylether, som beskrevet i trin 5.1.9 - 5.1.11. Efter kavalergang og udfældning af harpiks, indsamle peptid ved hjælp af centrifugering på 12.000 x g i 2 min.
    3. Tør den resulterende rest i et vakuum. Remanensen opløses i den afgassede DMF (50 mL) i en 100 mL rundbundet kolbe med henblik på at nå frem til en endelig koncentration på 0,5 mM (baseret på læsning af harpiks, 0,025 mmol (1000 mL/L / 0,5 mmol/L) = 50 mL).
      1. Tilføj photoinitiator DMPA (0,5-ækvivalent, 3,2 mg) og derefter afgasses reaktion i 10 min. ved hjælp af N2 gennem en lang nål strakte sig ind i løsningen. Næste, bestråle prøven under UV-lys ved stuetemperatur til 0,5 - 1 h uden agitation.
    4. Fjerne DMF under højt vakuum og udfælde den rå rest ved at tilføje diethylether for at opløse sin organiske biprodukter. Derefter, isolere restkoncentrationer ved hjælp af centrifugering på 12.000 x g i 2 min. Efter centrifugering, hæld forsigtigt komponenten ether. Fordampe rester til tørhed. Endelig Remanensen opløses i 1 mL H2O/acetonitril (2:1) og rense det ved hjælp af HPLC som beskrevet i trin 5.1.7.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

HPLC og MS-spektre af peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 og sin genindvundet produkt Ac - Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] - NH2 der blev genereret ved hjælp af på harpiks intramolekylære thiol-en photoreaction er afbildet i figur 6b. den cykliske peptid fandtes for at have en identisk Molekylær vægt i forhold til dens lineære forløber. Imidlertid blev sin HPLC retentionstid observeret for at være ca. 2 min. tidligere end i sin prækursorer på de samme betingelser, adskillelse. Korte peptider med forskellige sekvenser var alle observeret for at have en god konverteringsside, som afbilledet i figur 6 c.

Screeningen for thio-yne photoreaction betingelser er afbildet i figur 7B, og isomer konvertering og forholdet blev bestemt ved hjælp af integration af omvendt-fase HPLC. Kun sporingsniveauer af peptid 2c blev observeret efter UV-bestråling. Dette skyldes sandsynligvis en konformationel præference for en diffusering af de radikale på N-terminus thiyl under den ordregivende skridt til en 20-leddede macrocycle. Både peptider 1a og 1b fandtes for at generere to isomerer med en 8-medlem vinyl sulfid bitmapgenkendelse. Peptider 2a-A og 2a-B, der blev genereret fra peptid 1a, udstillet særskilte retentionstider samt forskellige nøgletal for forskellige UV-bestråling gange (0 - 30 min) (figur 7C). Disse blev tildelt som E/Z isomerer på grund af dobbeltbinding proton signaler på 1H-NMR spektroskopi (figur 7 d). I tilfælde af peptider 2d-2f, blev Z-isomeren fundet for at være den dominerende produkt. Dette er sandsynligvis på grund af den konformationelle præference under opførelsen af en kompakt struktur i forhold til 8-medlem vinyl sulfid bitmapgenkendelse. Afbilledet i figur 7E, ifølge cirkulære dichroism (CD) spektrum, peptider 2a-Baagøe og 2b-A/B, der råder over en 8-medlem vinyl sulfid bitmapgenkendelse udviser en tilfældig coil, mens peptid 2d, der råder over en 7-medlem vinyl sulfid bitmapgenkendelse udstiller en spiralformet kropsbygning. I Resumé, Z-isomeren af vinyl sulfid bond fandtes at være dannet fortrinsvis og vises en bedre helix induktion.

Figure 1
Figur 1: manuel peptid-syntese apparater til faste fase faststadie peptidsyntese. Kolonnerne blev placeret på den vakuum manifold gennem de trevejsspærreventiler og apparatet var tilsluttet en nitrogen eller argon gas linje for den boblende. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: den photoreactor enhed, der bruges til photoreactions. Enheden blev udstyret med ti 350 nm lamper (Table of Materials) for UV-bestråling og en argon gastank til at sikre, at photoreactor var fyldt med argon gas forud for og under photoreactions. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: harpiks intramolekylære thiol-en reaktion i tilfælde af kortere peptider. Denne reaktion blev udført ved hjælp af en på harpiks deprotection af trityl grupperne af cystein rester efter komplet syntesen af den lineære peptid og derefter angive harpiks til UV-bestråling ved hjælp af photoinitiators kort og MMP. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: intermolekylære thio-en reaktion på harpiks. Denne reaktion blev udført ved at opløse Fmoc-Cys-OH i DMF opløsningsmiddel og derefter bestrålet med Alken-bærende peptid rester på harpiks, efterfulgt af en macrolactamization ved hjælp af PyBop, HoBt og NMM som aktivering reagenser. Derefter faststadie peptidsyntese blev videreført ved hjælp af en standard SPP'ER. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: intramolekylære thiol-yne reaktion i løsning fase. Denne reaktion blev gennemført i den opklaring fase efter komplet syntesen af den lineære peptid, hvorefter den lineære peptid blev opløst i afgassede DMF og bestrålet ved hjælp af UV-lys med photoinitiator DMPA. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 6
Figur 6: Thioether tøjret cyklisk peptider genereret ved hjælp af en reaktion over på resin intramolekylære thiol-fjend. A. Dette panel viser ordningen på harpiks intramolekylære thio-en reaktion. mS5: "m" repræsenterer mono-erstattet olenic aminosyrer, "S" repræsenterer S konfigureret aminosyre, og "5" refererer til antallet af side kæde atomer38. B. denne paneler viser HPLC og MS-spektre af peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 forud for og efter sin cyclization. C. Dette panel viser konverteringen af de cykliske peptider med forskellige sekvenser. Dette tal er blevet ændret fra Zhao, B. et al.28 venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 7
Figur 7: peptid hæftning gennem foto-induceret thiol-yne hydrothiolation. A. Dette er en skematisk illustration af intramolekylære thiol-yne hydrothiolation. B. Dette panel viser peptid sekvenser vurderet i denne undersøgelse. Initiativtager: (I) 0,5 eq. DMPA, 1 h; (II) ingen initiativtager, 1 h; (III) 0,5 eq. DMPA, 0,5 eq. kort, 1 h; (IV) 0,5 eq. MMP, 0,5 h. C. Dette panel viser HPLC spor af reaktionsblandingen peptid 1a med forskellige UV bestråling gange og overvåges på 220 nm. D. Dette panel viser 1H-NMR spektre af 1a, 2a-A, og 2a-B (målt i DMSO-d6 på 400 MHz). Stjernerne tyder på dannelsen af en vinyl sulfid dobbeltbinding efter UV-bestråling. E. Dette panel viser de cirkulære dichroism spektre af peptider med vinyl sulfid cross-links. Dette tal er blevet ændret fra Tian, Y. et al. 44 Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Materialer MW N(0.5mmol / g harpiks × 0. 0 5 g × 5eq.) M(aminosyre) (mg)
(Da) (mmol)
Fmoc-Gly-OH 297 0,125 37,1
Fmoc-Ala-OH 331 0,125 41,4
Fmoc-Val-OH 339 0,125 42,4
Fmoc-Leu-OH 353 0,125 44.1
Fmoc-Ile-OH 353 0,125 44.1
Fmoc-Pro-OH 337 0,125 42.1
Fmoc-Phe-OH 387 0,125 48.4
Fmoc-Tyr (tBu)-OH 460 0,125 57,5
Fmoc-Trp (Boc)-OH 527 0,125 65,9
Fmoc-Ser (tBu)-OH 384 0,125 48
Fmoc-Thr (tBu)-OH 398 0,125 49,8
Fmoc-Cys (Trt)-OH 586 0,125 73,3
Fmoc-opfyldt-OH 372 0,125 46,5
Fmoc-Asn (Trt)-OH 597 0,125 74,6
Fmoc-Localisation (Trt)-OH 611 0,125 76,4
Fmoc-Asp (OtBu)-OH 412 0,125 51,5
Fmoc-Glu (OtBu)-OH 426 0,125 53,3
Fmoc-Lys (Boc)-OH 469 0,125 58,6
Fmoc-Arg (Pbf)-OH 617 0,125 77,1
Fmoc-hans (Trt)-OH 620 0,125 77,5
HCTU 414 0.122 50,5
DIPEA 129 0,25 43.5(ΜL)
DMF 0,5 mL

Tabel 1: Mængder af kobling betingelser.

Kolonne Zorbax SB-Aq kolonne, 4,6 × 250 mm (porestørrelse 80 Å, partikel størrelse 5 μm)
Opløsningsmidler A: vand, 0,1% (vol/vol) TFA; B: acetonitril
Strømningshastighed 1 mL/min
Gradient 20-70% (vol/vol) B over 25 min; 70% - 98% over 5 min; 98% over 5min;
Injektionsvolumen 30 – 500 ΜL
Bølgelængde (nm) 280 (for Fmoc - Trp- eller Tyr-indeholder peptider), eller 494 (FITC-mærket peptider) eller 220 (til andre)

Tabel 2: High-performance væskekromatografi betingelser.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I på harpiks intramolekylære thio-en cyclization beskrevet i figur 3, blev fjernelse af trityl gruppen af cystein rester fundet for at være et afgørende skridt for den efterfølgende photoreaction. Derudover afbildet peptid molekylvægt forud for og efter reaktionen blev anset for at være den samme som i fig. 6B. Derfor, anvendelse af en HPLC identifikation eller en DTNB analyse er påkrævet for at overvåge reaktionen. I tilfælde af intermolekylære thio-en reaktion beskrives i figur 4, er MS overvågning nødvendig. Mens et yderligere trin i lactam kobling fandtes for at være nødvendig for opførelsen af en thioether snor, foreslår vi, at denne protokol vil blive brugt til lange peptider for at opnå en samlet set højere effektivitet.

Vinyl sulfid bond genereret af thio-yne photoreaction var ikke stabile i den stærkt sure TFA løsning, der bruges til harpiks kavalergang. Derfor blev brugen af thio-yne photoreaction i opklaring fasen vedtaget. Denne reaktion blev fortyndet til en lav koncentration (0,5 mM) for at undgå potentielle intermolekylære af reaktioner. Det er også lige så vigtigt at degas opløsningsmidlet for at undgå produkt oxidation under photoreactions. Efter reaktionen, vakuum fordampning af den organiske opløsningsmidler DMF bør også nøje gennemføres for at forhindre peptid oxidation/nedbrydning eller maskiner afskrivning. Thio-yne cyclization reaktion afbildet i figur 5 indeholder en mekanisme til post faststadie peptidsyntese ændring35.

Mens den intramolekylære thiol-en reaktion med succes genereret thioether tøjret peptider med god konverteringsside, undladt en simpel thioether cross-link at begrænse peptider til den ønskede spiralformet kropsbygning. Baseret på denne på tether ændring strategi, en i tøjr chiral center induceret peptid helicity konceptet blev udviklet, hvor γ substitueret gruppe med R konfigurationen på peptid C-terminale var i stand til at fremkalde den peptid spiralformet kropsbygning ( Figur 4)39,40. Den begrænsning, der er forbundet med denne tilgang er syntesen af den enantiomerically ren unaturlige aminosyre med to chiral Centre (α (S), γ(R))41,42.

Denne forskning viste, at thio-yne reaktion kan begrænse peptid i en spiralformet kropsbygning med god konverteringsside, som afbilledet i figur 7E. Med hensyn til opførelsen af spiralformet peptider anbefaler vi thio-yne photoreaction til opførelse af spiralformet peptider. På harpiks intramolekylære thio-en cyclization blev vist sig for at være egnet til opførelse af korte thioether tether peptider (mindre end 15) i tilfælde af lange peptider er også fleksible til at sikre effektiv cyclization. Derudover anbefales på harpiks intermolekylære thio-en cyclization for lang peptid cyclization.

I sammendrag, har vi udviklet en serie af kemiske protokoller til opførelse af thioether/vinyl sulfid tøjret peptider ved hjælp af lysinducerede thio-fje/thio-yne Klik kemi. Reaktionen er effektiv, metal katalysator-fri, bekvemt for manipulationer, og har været demonstreret at besidde en overlegen funktionsgruppe tolerance og bio-ortogonale. Denne metode blev videreudviklet for at stabilisere andre peptid sekundære strukturer som en β-hårnål43,44. Dette papir viser, at thioether tether indeholder en traceless ændring site. Dette udvider i høj grad den kemiske plads efter peptid syntese ændring. Derudover alifatiske thioether/vinyl sulfid tøjret peptider, der udstillet en reduceret membran toksicitet i forhold til kulbrinte korte syntetiske peptider anvendes i forskellige biologiske applikationer med demonstreret god bioactivity og biotilgængelighed45,46.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Acknowledgments

Forfatterne anerkender økonomisk støtte fra Natural Science Foundation i Kina tilskud (nr. 21372023, 21778009 og 81701818); Ministeriet for videnskab og teknologi i Folkerepublikken Kina (No. 2015DFA31590); Shenzhen videnskab og teknologi Innovation Udvalget (nr. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 og GJHS20170310093122365); og Kina postdoc Science Foundation (No. 2017 M 610704).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, dP., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Chemistry. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , In Press (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides' permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Chemistry. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

Kemi spørgsmålet 138 Thio-fje/yne reaktion foto-induceret cystein thioether stabilisering spiralformet peptider protein-protein interaktioner
Konstruere Thioether/Vinyl sulfid-tøjret spiralformet peptider Via foto-induceret Thiol-fje/yne Hydrothiolation
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z.… More

Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter