Rekombinante Kollagen Modell I Peptid-Microcarriers für Zelle Expansion und ihre mögliche Verwendung als Zelle-Delivery-System in einem Bioreaktor
Summary
Wir schlagen eine Zelle Erweiterung Protokoll über makroporöse Microcarriers und deren Verwendung als Delivery-System in einem Bioreaktor Perfusion eine decellularized Gewebe-Matrix zu säen. Wir gehören auch verschiedene Techniken um Zellproliferation und Lebensfähigkeit der Zellen kultiviert auf Microcarriers zu bestimmen. Darüber hinaus zeigen wir die Funktionalität der Zellen nach Bioreaktor Kulturen.
Abstract
Gewebe-Engineering ist ein vielversprechendes Feld, konzentrierte sich auf die Entwicklung von Lösungen für die steigende Nachfrage auf Gewebe und Organe zur Transplantationszwecke. Der Prozess um solche Gewebe zu generieren ist komplex und beinhaltet eine geeignete Kombination von bestimmten Zelltypen, Gerüste und körperliche oder biochemische Reize, Zellwachstum und Differenzierung zu führen. Microcarriers stellen eine ansprechende Werkzeug, Zellen in eine dreidimensionale (3D) Mikroumgebung zu erweitern, da sie höhere Oberfläche-Volumen-Verhältnis bieten und die in-Vivo -Situation im Vergleich zu herkömmlichen zweidimensionalen Methoden genauer zu imitieren. Das Gefäßsystem, liefert Sauerstoff und Nährstoffe zu den Zellen und die Gewährleistung der Abfallentsorgung, stellt einen wichtigen Baustein bei der Erzeugung von Geweben entwickelt. In der Tat fallen die meisten Konstrukte nach aufgrund fehlender vaskulären Unterstützung implantiert. In dieser Studie stellen wir ein Protokoll für die Endothelzellen Expansion auf rekombinante Kollagen-basierten Microcarriers unter dynamischen Bedingungen in Spinner Kolben und Bioreaktoren, und wir erklären, wie man in dieser Einstellung Zellviabilität und Funktionalität bestimmen. Darüber hinaus schlagen wir eine Methode für die Zelle Lieferung Vaskularisierung Zwecken ohne zusätzliche Ablösung Schritte notwendig. Darüber hinaus bieten wir eine Strategie, um die Zelle Vaskularisierung Potenzial in einem Bioreaktor Perfusion auf eine decellularized biologische Matrix bewerten. Wir glauben, dass die Nutzung der vorgestellten Methoden zur Entwicklung neuer zellbasierte Therapien für eine Vielzahl von Tissue engineering-Anwendungen in der klinischen Praxis führen könnte.
Introduction
Ein generelles Problem in Gewebe-engineering-Anwendungen ist eine hohe Zellmasse mit dem richtigen Differenzierung Phänotyp an der Stelle des weichen müssen. Die Anwendung des Microcarriers zur Behebung dieses Problems begann 1967 mit zunehmender Bedeutung bis heute in den Bereichen orthopädische Gewebetechnik für groß angelegte Generation von Haut, Knochen, Knorpel und Sehnen1. Sie ermöglichen das Handling von anhaftenden Kulturen in Hinsicht ähnelt der Aussetzung Cultures2 durch den Ausbau der Zellen auf Microscale dreidimensionale (3D) Substraten. Dabei erleben die Zellen eine homogene Nährstoffversorgung und Zelle-Matrix Interaktionen, dass Blei, bessere Wartung der in Vivo3,4 Differenzierung, die oft verloren im Laufe der Zeit in 2D5nähert. Eine höhere Oberflächen-Volumen-Verhältnis – führt schließlich zu einer Zelle höhere Erträge6,7, höhere gas und Nährstoff Wechselkurse im Vergleich zu statischen Systemen8, die Möglichkeit zu regulieren und die Kultur nach körperlichen Reize9und das Potenzial für die Aufstockung der Erweiterung Prozess7 sind weitere Vorteile. Verschiedene Funktionen wie Durchmesser, Dichte, Porosität, Oberflächenladung und Adhäsion Eigenschaften10,11 unterscheiden die verschiedenen im Handel erhältlichen Mikro – und Makro-Träger. Einer der wichtigsten Vorteile ist jedoch deren Potenzial als Microtissues Zustellung an Seite defekt oder Nachfrage.
Für Anwendungen der Microcarrier Technologie im Knochen Tissue Engineering, illustriert wir in einem früheren Bericht12 die Produktion der neuen Microcarrier Typ konstituiert eine rekombinante Kollagen ich Peptid (RCP, als Cellnest im Handel erhältlich). Diese neue Microcarrier ermöglicht die GMP-gerechte, Skalierung von Gerüst und Zelle Produktion Bedarf für die Zelle Lieferung in einem klinischen Szenario. In diesem Zusammenhang ermöglicht tuning Gerüst Stabilität, Abbaurate und Oberflächeneigenschaften durch geeignete Wahl einer geeignet Vernetzung Strategie anzupassen, die Technik, um die ausgewählte Anwendung, Zelltyp von Interesse oder gezielt Gewebe13. Vor allem macht der mögliche Einsatz von dieser Microcarrier als eine injizierbare Zelle Liefersystem für therapeutische Anwendung14 sie besonders interessant in einem klinischen Umfeld.
In diesem Beitrag zeigen wir daher die Kultivierung Verfahren zur Isolierung und Erweiterung der menschlichen Knochenmark stammenden mesenchymaler Stromazellen Zellen (hBMSCs) und menschlichen dermalen mikrovaskuläre Endothelzellen (HDMECs) auf Kollagen-ich-basierten rekombinante Peptid-basierte Microcarriers und deren Vorbereitung für die Lieferung in einem klinischen Umfeld. Darüber hinaus beschreiben wir Zusatzprotokolle nützlich für die Aufrechterhaltung der Zellviabilität nach Implantation.
Zellviabilität nach der Implantation ist in der Tat stark abhängig von Vaskularisierung15,16,17, der Austausch von Sauerstoff und Nährstoffen gewährleistet und erleichtert die Entsorgung. Bioreaktoren sind ein Ansatz um Vaskularisierung meistern in Gewebe-Engineering und pflegen Zellviabilität durch Perfusion Kulturmedium bietet dabei Sauerstoff und Nährstoffe18. Hier zeigen wir eine in-vitro- Methode zur Bewertung der Migration Fähigkeit mikrovaskuläre Endothelzellen aus der RCP-Microcarriers zu einem Biomatrix und ihre Fähigkeit, de Novo Vaskularisierung und Angiogenese beizutragen. Diese Biomatrix ist ein decellularized Segment des porcinen Jejunum bezeichnet BioVaSc (biologische durchblutet Gerüst), reich an Kollagen und Elastin und vaskulären Strukturen, einschließlich Fütterung Arterie und eine drainierende Vene19 , die wurde mit bewahrt Einnistung Fragen20beantragt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ein Hauptziel des Microcarrier ist der Ausbau der Zellen unter Beibehaltung ihrer Differenzierung um Zellen an die Notwendigkeit zu liefern. Die dargestellte Methode einzuführen RCP Microcarriers Zellen in der Lage zu befestigen, vermehren und besiedeln die Microcarriers mit hoher Zelldichte waren. Dies wurde von lebenden/Toten Färbung, beobachtet, in denen mehr als 90 % der lebensfähigen Zellen gefunden wurden, während nur wenige Tote Zellen nach 7 Tagen des dynamischen Kulturen gewonnen wurden. Ebenso bestätigt di…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Forschung führt zu diesen Ergebnissen wird finanziell von der Europäischen Union siebten Rahmen Programm RP7/2007-2013 unter Grant Vereinbarung n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Wir danken Carolien van Spreuwel-Goossens von Fujifilm Manufacturing Europe b.v., für technische Hilfe bei der RCP-Herstellung und Werner Stracke vom Fraunhofer-Institut für Silikat Research ISC, um Unterstützung bei der SEM-Analyse.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
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