Biz macroporous microcarriers bir hücre genişletme protokolü ve kullanımları decellularized doku matris temel için bir perfüzyon biyoreaktör teslim sistemi olarak öneriyoruz. Biz de hücre çoğalması ve canlılığı üzerinde microcarriers kültürlü hücre belirlemek için farklı teknikler içerir. Ayrıca, biyoreaktör kültürler sonra hücreleri işlevselliğini göstermektedir.
Doku Mühendisliği için artan talep üzerine doku ve organ nakli amacıyla ilgili çözümler geliştirilmesi üzerinde duruldu gelecek vaat eden bir alandır. Böyle dokular oluşturmak için işlemi karmaşıktır ve belirli hücre tipleri, iskele ve hücre büyüme ve farklılaşma rehberlik için fiziksel ve biyokimyasal uyaranlara uygun bir kombinasyonunu içerir. Microcarriers beri onlar daha yüksek yüzey-hacim oranları sağlamak ve daha yakından geleneksel iki boyutlu yöntemlerine göre vivo içinde durum taklit bir üç boyutlu (3D) microenvironment hücrelerde genişletmek için çekici bir araç temsil eder. Ne zaman üreten dokuları mühendislik damar sistemi, oksijen ve besin hücrelere temini ve atık kaldırma, sağlanması önemli bir yapı taşı kabul ettiğiniz anlamına gelir. Aslında, çoğu yapıları sonra implante vasküler desteği eksik nedeniyle başarısız. Bu çalışmada, ve biz rekombinant kollajen tabanlı microcarriers spinner şişesi ve Biyoreaktörler dinamik koşullar altında bir protokol endotel hücre genişletme için mevcut bu ayarı hücre canlılığı ve işlevselliği seçileceğinin nasıl belirlendiği açıklanmaktadır. Buna ek olarak, gerekli ek dekolmanı adımları olmadan vaskülarizasyon amacıyla hücre teslimat için bir yöntem öneriyorum. Ayrıca, hücre vaskülarizasyon perfüzyon biyoreaktör decellularized biyolojik matris üzerinde potansiyel değerlendirmek için bir stratejisi sağlayabilir. Biz sunulan yöntemleri için doku mühendisliği uygulamaları klinik pratikte çok sayıda yeni hücre tabanlı terapiler gelişmesine neden olabilir inanıyoruz.
Doku Mühendisliği uygulamalarında bir genel sorun bulunduğu konumda doğru farklılaşma fenotip ile yüksek hücre kütlesi verim için ihtiyaç vardır. Bu sorunu gidermek için microcarriers uygulanması ile deri, kemik, kıkırdak ve tendon1büyük ölçekli üretimi için ortopedik doku Mühendisliği gibi alanlara bugüne önemi artan 1967 yılında başladı. Yapisan kültürler işlenmesi şekillerde süspansiyon kültürler2 benzer hücreler microscale üç boyutlu (3D) yüzeyler üzerinde genişleterek sağlarlar. Böylece hücreleri homojen bir besin kaynağı ve hücre-matris etkileşimleri kurşun kez 2D zamanla kaybolur vivo içinde3,4 farklılaşma daha iyi bakım için5yaklaşımlar deneyim. Bir daha yüksek yüzey hacim oranı – sonunda lider daha yüksek verimleri6,7hücre, daha yüksek gaz ve besin döviz kurlarını statik sistemleri8, düzenleyen ve kültür için fiziksel konu imkanı karşılaştırarak daha fazla bir çekim gücü9ve genişleme süreci7 / yükseltme için potansiyel avantajları vardır. Çapı, yoğunluk, gözeneklilik, yüzey ücret ve yapışma özelliklerini10,11 gibi bazı özellikler farklı piyasada bulunan mikro – ve makro-taşıyıcıları ayırt. Ancak, ana avantaj onların teslim microtissues potansiyel sitesi kusur veya isteğe bağlı biridir.
Microcarrier teknoloji kemik doku mühendisliği uygulamaları için üretimi bir önceki rapor12 ‘ resimli yeni bir microcarrier türü oluşturmuştur rekombinant kollajen ben peptid (RCP, Cellnest piyasada bulunan). Bu yeni microcarrier GMP iskele ve hücre üretimi, ölçekleme kadar uyumlu cep teslim klinik senaryosunda için gerektiği gibi sağlar. Bu bağlamda, iskele istikrar, bozulma hızı ve yüzey özellikleri uygun crosslinking strateji uygun seçim yoluyla ayarlama, faiz türü hücre veya doku13hedef seçilen uygulama için teknik uyum sağlar. Özellikle, bu microcarrier olası istihdam enjekte edilebilir hücre teslim sistemi tedavi uygulama14 olarak onları özellikle ilginç bir klinik ortamda yapar.
Bu yazıda, bu nedenle kodlamayla için prosedür yalıtım ve genişlemesi insan kemik iliği elde edilen Mezenkimal stromal hücreler (hBMSCs) ve insan dermal mikrovasküler endotel hücreleri (HDMECs) kolajen-ben-merkezli rekombinant üzerinde göstermek peptid tabanlı microcarriers ve onların Hazırlık’dır bir klinik ortamda. Ayrıca, ek protokoller hücre canlılığı implantasyon üzerine bakımı için yararlı açıklar.
Hücre canlılığı implantasyonu sonrası aslında oksijen ve besin alışverişini sağlar ve atık kaldırma kolaylaştıran vaskülarizasyon15,16,17, kuvvetle bağlıdır. Biyoreaktörler doku Mühendisliği yapılan vaskülarizasyon zorlukların üstesinden ve perfüzyon kültür böylece oksijen ve besin18sağlayan orta aracılığıyla hücre canlılığı korumak için bir yaklaşım teşkil. Burada, biz RCP microcarriers mikrovasküler endotel hücrelerden bir biomatrix ve yeteneklerini de novo vaskülarizasyon ve anjiogenezi katkıda bulunmak için geçiş yeteneği değerlendirmek için bir vitro yöntemi göstermektedir. Domuz değişir decellularized bir parçasını BioVaSc (biyolojik skarların iskele) kolajen ve elastin açısından zengin olarak adlandırdığı ve besleme arter içeren vasküler yapılar ve olmuştur boşaltma bir damar19 ile korunmuştur bu biomatrix olduğunu implantasyon sorunları20için uygulanan.
Bir ana microcarrier hücreleri gerek yere yerine getirmeleri için onların farklılaşma korurken hücreleri genişlemesi hedefidir. Temsil yöntemi tanıtmak hücreleri eklemek, çoğalırlar ve microcarriers yüksek hücre yoğunluğu ile kolonize neredeydin RCP microcarriers. Bu Canlı/Boyama, sadece birkaç ölü hücreleri dinamik kültürler 7 gün sonra elde edilmiştir sırada hangi hücrelerin fazla % 90 algılandı ölü tarafından gözlenmiştir. Aynı şekilde, SEM görüntüleri hücreleri kültürleri 7 …
The authors have nothing to disclose.
Bu sonuçlar için önde gelen araştırma Avrupa Birliği yedinci çerçeve programı FP7/2007-2013 gelen hibe sözleşmesi n ° 607051 altında (BIO-ilham) fon aldı. Carolien van Spreuwel-Goossens Fujifilm üretim Avrupa B.V., üzerinden RCP imalat ve Werner Stracke Fraunhofer Enstitüsü sırasında SEM çözümleme konusunda yardım almak için teknik destek silikat araştırma ISC için için müteşekkiriz.
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
Cellnest | Fujifilm | ||
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Peristaltic pump | Ismatec | ||
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |