Rekombinant kollagen jag peptid Microcarriers för Cell Expansion och deras potentiella användning som Cell leverans System i en bioreaktor modell
Summary
Vi föreslår en cell expansion protokollet om får microcarriers och deras användning som leverans system i ett perfusion bioreaktor till utsäde en cell-lösa vävnadsmatris. Vi har även olika tekniker för att bestämma cellproliferation och viabiliteten hos celler som odlas på microcarriers. Vi visar dessutom funktionalitet av celler efter bioreaktor kulturer.
Abstract
Vävnadsteknik är ett lovande fält, fokuserade på att utveckla lösningar för den ökande efterfrågan på vävnader och organ angående transplantation ändamål. Processen att generera sådana vävnader är komplicerad och omfattar en lämplig kombination av specifika celltyper, ställningar och fysiska eller biokemiska stimuli att vägleda celltillväxt och differentiering. Microcarriers representerar ett tilltalande verktyg att expandera celler i en tredimensionell (3D) närmiljön, eftersom de ger högre yta-till volym nyckeltal och efterlikna närmare i vivo situationen jämfört med traditionella tvådimensionella metoder. Det vaskulära systemet, tillhandahålla syre och näringsämnen till cellerna och garantera avfallshantering, utgör en viktig byggsten när genererar konstruerad vävnader. I själva verket misslyckas de flesta konstruktioner efter att implanteras på grund av bristande vaskulär stöd. I denna studie presenterar vi ett protokoll för endotelceller expansion på rekombinant kollagenbaserade microcarriers under dynamiska förhållanden i spinner kolv och bioreaktorer och förklarar vi hur du avgöra i denna inställning cellernas viabilitet och funktionalitet. Dessutom föreslår vi en metod för cell leverans för vaskularisering utan ytterligare avlossning nödvändiga steg. Dessutom erbjuder vi en strategi för att utvärdera den cell vaskularisering potentiella i ett perfusion bioreaktor på en cell-lösa biologiska matris. Vi anser att användningen av de presenterade metoderna kan leda till utvecklingen av nya cellbaserade terapier för ett stort utbud av vävnad tekniska tillämpningar i klinisk praxis.
Introduction
Ett allmänt problem i tissue engineering program är att ge en hög cellmassan med den rätta differentiering fenotypen på plats behöver. Tillämpningen av microcarriers som löser problemet startade 1967 med ökande betydelse hittills inom områden såsom ortopedisk vävnadsteknik för storskaliga generation av hud, ben, brosk och senor1. De tillåter hantering av vidhäftande kulturer på sätt liknar suspension kulturer2 genom att utvidga celler på hur provtagningsutrustningen skall tredimensionella (3D) substrat. Därmed uppleva celler en homogen näringstillförsel och cell-matrix interaktioner att leda till bättre underhåll av i vivo3,4 differentiering som ofta försvinner med tiden i 2D närmar sig5. Förhållandet för högre yta till volym – så småningom leder till högre cellen avkastning6,7, högre gas och näringsämnen valutakurser jämfört med statiska system8, möjligheten att reglera och utsätta kulturen för fysiska stimuli9, och potentialen för uppskalning av expansion process7 är ytterligare fördelar. Flera funktioner såsom diameter, densitet, porositet, ytladdning och vidhäftning boenden10,11 skilja de olika kommersiellt tillgängliga mikro – och makro-bärare. En av den största fördelen är dock deras leverans potential som microtissues till webbplatsen defekt eller efterfrågan.
För applikationer av microcarrier teknik i ben vävnadsteknik, vi illustreras i en tidigare rapport12 produktionen av en ny microcarrier typ utgjorde av ett rekombinant kollagen jag peptid (RCP, kommersiellt tillgängliga som Cellnest). Denna nya microcarrier tillåter det GMP-kompatibelt skala byggnadsställning och cell produktion, som behövs för cell leverans i kliniska scenario. I detta sammanhang tillåter trimning av byggnadsställning stabilitet, nedbrytningshastigheten och ytegenskaper genom rätt val av en lämplig crosslinking strategi att anpassa tekniken till det valda programmet, cell typ av intresse eller rikta vävnad13. I synnerhet gör potentiella anställningen av denna microcarrier som en injicerbara cell leveranssystem för terapeutiska program14 dem särskilt intressant i en klinisk miljö.
I detta papper illustrera vi därför culturing förfarandet för isolering och expansion av mänsklig benmärg-derived mesenkymala stromaceller (hBMSCs) och mänskliga dermal mikrovaskulära endotelceller (HDMECs) på kollagen-I-baserade rekombinant peptidbaserade microcarriers och deras förberedelser för leverans i en klinisk miljö. Dessutom beskriver vi tilläggsprotokollen användbar för underhåll av cellernas viabilitet vid implantation.
Cellernas viabilitet efter implantation är starkt beroende av vaskularisering15,16,17, vilket säkerställer utbytet av syre och näringsämnen och underlättar avfallshantering. Bioreaktorer utgör en metod för att övervinna vaskularisering utmaningar i vävnadsteknik och underhålla cellernas viabilitet, genom genomblödning av odlingsmedium som tillhandahåller därmed syre och näringsämnen18. Här, illustrera vi en in vitro- Metod för att utvärdera funktionen migration av mikrovaskulära endotelceller från den RCP microcarriers till en biomatrix och deras förmåga att bidra till de novo vaskularisering och angiogenes. Denna biomatrix är ett cell-lösa segment av svin jejunum kallas BioVaSc (biologiska vaskulariserad byggnadsställning), rik på kollagen och elastin och med bevarade vaskulära strukturer, som inkluderar en utfodring artär och en dränerande ven19 som har varit tillämpas för implantation problem20.
Protocol
Representative Results
Discussion
En huvudsakliga målet med microcarrier är en utbyggnad av celler samtidigt som deras differentiering för att kunna leverera celler till förlägga av behovet. Metoden representerade införa RCP microcarriers där celler kunde bifoga, föröka sig och kolonisera microcarriers med hög cell densiteten. Detta observerades av live/dead färgning, där mer än 90% av viabla celler upptäcktes medan endast några döda celler erhölls efter 7 dagar av dynamiska kulturer. Jämväl, SEM bilder bekräftade att cellerna täckte…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från Europeiska unionens sjunde ram programmet FP7/2007 – 2013 enligt grant avtalet n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Vi tackar Carolien van Spreuwel-Goossens från Fujifilm Manufacturing Europe B.V., för tekniskt bistånd under RCP tillverkning och Werner Stracke från Fraunhofer Institute för silikat forskning ISC, för hjälp med SEM analys.
Materials
| 3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
| 4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
| Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
| Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
| Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
| Cellnest | Fujifilm | ||
| Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
| Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
| DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
| Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
| Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
| Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
| Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
| Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
| Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
| Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
| Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
| Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
| Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
| Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
| Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
| Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
| Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
| Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| Peristaltic pump | Ismatec | ||
| Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
| Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
| Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
| Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
| Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
| Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
| Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
| Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
| VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |
References
- Li, B., et al. Past, present, and future of microcarrier-based tissue engineering. Journal of Orthopaedic. 3 (2), 51-57 (2015).
- Rodrigues, M. E., Costa, A. R., Henriques, M., Azeredo, J., Oliveira, R. Evaluation of solid and porous microcarriers for cell growth and production of recombinant proteins. Methods Mol Biol. 1104, 137-147 (2014).
- Akhmanova, M., Osidak, E., Domogatsky, S., Rodin, S., Domogatskaya, A. Physical, Spatial, and Molecular Aspects of Extracellular Matrix of In Vivo Niches and Artificial Scaffolds Relevant to Stem Cells Research. Stem Cells Int. 2015, 167025 (2015).
- Sart, S., Tsai, A. C., Li, Y., Ma, T. Three-dimensional aggregates of mesenchymal stem cells: cellular mechanisms, biological properties, and applications. Tissue Eng Part B. Rev. 20, 365-380 (2014).
- Fitzgerald, K. A., Malhotra, M., Curtin, C. M., Brien, F. J. O., O’Driscoll, C. M. Life in 3D is never flat: 3D models to optimise drug delivery. Journal of Controlled Release. 215, 39-54 (2015).
- Tan, K. Y., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Recent advances in serum-free microcarrier expansion of mesenchymal stromal cells: Parameters to be optimized. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473, 769-773 (2016).
- de Soure, A. M., Fernandes-Platzgummer, A., da Silva, C. L., Cabral, J. M. Scalable microcarrier-based manufacturing of mesenchymal stem/stromal cells. J Biotechnol. 236, 88-109 (2016).
- Schop, D., et al. Expansion of human mesenchymal stromal cells on microcarriers: growth and metabolism. J Tissue Eng Regen. Med. 4, 131-140 (2010).
- Carmelo, J. G., Fernandes-Platzgummer, A., Diogo, M. M., da Silva, C. L., Cabral, J. M. A xeno-free microcarrier-based stirred culture system for the scalable expansion of human mesenchymal stem/stromal cells isolated from bone marrow and adipose tissue. Biotechnol J. 10, 1235-1247 (2015).
- Malda, J., Frondoza, C. G. Microcarriers in the engineering of cartilage and bone. Trends Biotechnol. 24, 299-304 (2006).
- Chen, A. K., Reuveny, S., Oh, S. K. Application of human mesenchymal and pluripotent stem cell microcarrier cultures in cellular therapy: achievements and future direction. Biotechnol Adv. 31, 1032-1046 (2013).
- Confalonieri, D., La Marca, M., van Dongen, E., Walles, H., Ehlicke, F. An Injectable Recombinant Collagen I Peptide-Based Macroporous Microcarrier Allows Superior Expansion of C2C12 and Human Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stromal Cells and Supports Deposition of Mineralized Matrix. Tissue Eng Part A. , (2017).
- Davidenko, N., et al. Control of crosslinking for tailoring collagen-based scaffolds stability and mechanics. Acta biomaterialia. 25, 131-142 (2015).
- Jin, G. Z., Park, J. H., Seo, S. J., Kim, H. W. Dynamic cell culture on porous biopolymer microcarriers in a spinner flask for bone tissue engineering: a feasibility study. Biotechnol Lett. 36, 1539-1548 (2014).
- Bae, H., et al. Building Vascular Networks. Science Translational Medicine. 4 (160), 160ps23 (2012).
- Cao, L., Wang, J., Hou, J., Xing, W., Liu, C. Vascularization and bone regeneration in a critical sized defect using 2-N, 6-O-sulfated chitosan nanoparticles incorporating BMP-2. Biomaterials. 35 (2), 684-698 (2014).
- Novosel, E., Kleinhans, C., Kluger, P. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Cartmell, S. H., Porter, B. D., García, A. J., Guldberg, R. E. Effects of medium perfusion on cell-seeded three-dimensional bone constructs in vitro. Tissue Engineering. 9 (6), 1197-1203 (2004).
- Schanz, J., Pusch, J., Hansmann, J., Walles, H. Vascularised human tissue models: a new approach for the refinement of biomedical research. Journal of biotechnology. 148 (1), 56-63 (2010).
- Steinke, M., Gross, R., Walles, H., Schütze, K., Walles, T. An engineered 3D human airway mucosa model based on a SIS scaffold. Biomaterials. 35 (26), 7355-7362 (2014).
- Moll, C., et al. Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System. J. Vis. Exp. (78), e50460 (2013).
- Groeber, F., Kahlig, A., Loff, S., Walles, H., Hansmann, J. A bioreactor system for interfacial culture and physiological perfusion of vascularized tissue equivalents. Biotechnology Journal. 8, 308-316 (2013).
- Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K., Walter, P. Blood vessels and endothelial cells. Molecular Biology of the Cells. , (2002).
- Logsdon, E. A., Finley, S. D., Popel, A. S., Gabhann, F. M. A systems biology view of blood vessel growth and remodeling. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 18 (8), 1491-1508 (2014).
- Scheller, K., Dally, I., Hartmann, N., Münst, B., Braspenning, J., Walles, H. Upcyte® Microvascular endothelial cells repopulate decellularized scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 19 (1), 57-67 (2012).
- Nietzer, S., et al. Mimicking Metastases Including Tumor Stroma: A New Technique to Generate a Three-Dimensional Colorectal Cancer Model Based on a Biological Decellularized Intestinal Scaffold. Tissue Engineering Part C: Methods. 22 (7), 621-635 (2016).
- Göttlich, C., et al. A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds. J. Vis. Exp. (110), e53885 (2016).
- Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Molecular oncology. 8 (2), 351-365 (2014).
- Groeber, F., et al. A first vascularized skin equivalent for as an alternative to animal experimentation. Altex. 33 (4), 415-422 (2016).
- Plunkett, N., O’Brien, F. J. Bioreactors in tissue engineering. Technology and Health Care. 19 (1), 55-69 (2011).
- Nienow, A. W., Rafiq, Q. A., Coopman, K., Hewitt, C. J. A potentially scalable method for the harvesting of hMSCs from microcarriers. Biochemical Engineering Journal. 85, 79-88 (2014).
- Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections. Cold Spring Harbor Protocols. 2008 (5), pdb-prot4986 (2008).
