Vi föreslår en cell expansion protokollet om får microcarriers och deras användning som leverans system i ett perfusion bioreaktor till utsäde en cell-lösa vävnadsmatris. Vi har även olika tekniker för att bestämma cellproliferation och viabiliteten hos celler som odlas på microcarriers. Vi visar dessutom funktionalitet av celler efter bioreaktor kulturer.
Vävnadsteknik är ett lovande fält, fokuserade på att utveckla lösningar för den ökande efterfrågan på vävnader och organ angående transplantation ändamål. Processen att generera sådana vävnader är komplicerad och omfattar en lämplig kombination av specifika celltyper, ställningar och fysiska eller biokemiska stimuli att vägleda celltillväxt och differentiering. Microcarriers representerar ett tilltalande verktyg att expandera celler i en tredimensionell (3D) närmiljön, eftersom de ger högre yta-till volym nyckeltal och efterlikna närmare i vivo situationen jämfört med traditionella tvådimensionella metoder. Det vaskulära systemet, tillhandahålla syre och näringsämnen till cellerna och garantera avfallshantering, utgör en viktig byggsten när genererar konstruerad vävnader. I själva verket misslyckas de flesta konstruktioner efter att implanteras på grund av bristande vaskulär stöd. I denna studie presenterar vi ett protokoll för endotelceller expansion på rekombinant kollagenbaserade microcarriers under dynamiska förhållanden i spinner kolv och bioreaktorer och förklarar vi hur du avgöra i denna inställning cellernas viabilitet och funktionalitet. Dessutom föreslår vi en metod för cell leverans för vaskularisering utan ytterligare avlossning nödvändiga steg. Dessutom erbjuder vi en strategi för att utvärdera den cell vaskularisering potentiella i ett perfusion bioreaktor på en cell-lösa biologiska matris. Vi anser att användningen av de presenterade metoderna kan leda till utvecklingen av nya cellbaserade terapier för ett stort utbud av vävnad tekniska tillämpningar i klinisk praxis.
Ett allmänt problem i tissue engineering program är att ge en hög cellmassan med den rätta differentiering fenotypen på plats behöver. Tillämpningen av microcarriers som löser problemet startade 1967 med ökande betydelse hittills inom områden såsom ortopedisk vävnadsteknik för storskaliga generation av hud, ben, brosk och senor1. De tillåter hantering av vidhäftande kulturer på sätt liknar suspension kulturer2 genom att utvidga celler på hur provtagningsutrustningen skall tredimensionella (3D) substrat. Därmed uppleva celler en homogen näringstillförsel och cell-matrix interaktioner att leda till bättre underhåll av i vivo3,4 differentiering som ofta försvinner med tiden i 2D närmar sig5. Förhållandet för högre yta till volym – så småningom leder till högre cellen avkastning6,7, högre gas och näringsämnen valutakurser jämfört med statiska system8, möjligheten att reglera och utsätta kulturen för fysiska stimuli9, och potentialen för uppskalning av expansion process7 är ytterligare fördelar. Flera funktioner såsom diameter, densitet, porositet, ytladdning och vidhäftning boenden10,11 skilja de olika kommersiellt tillgängliga mikro – och makro-bärare. En av den största fördelen är dock deras leverans potential som microtissues till webbplatsen defekt eller efterfrågan.
För applikationer av microcarrier teknik i ben vävnadsteknik, vi illustreras i en tidigare rapport12 produktionen av en ny microcarrier typ utgjorde av ett rekombinant kollagen jag peptid (RCP, kommersiellt tillgängliga som Cellnest). Denna nya microcarrier tillåter det GMP-kompatibelt skala byggnadsställning och cell produktion, som behövs för cell leverans i kliniska scenario. I detta sammanhang tillåter trimning av byggnadsställning stabilitet, nedbrytningshastigheten och ytegenskaper genom rätt val av en lämplig crosslinking strategi att anpassa tekniken till det valda programmet, cell typ av intresse eller rikta vävnad13. I synnerhet gör potentiella anställningen av denna microcarrier som en injicerbara cell leveranssystem för terapeutiska program14 dem särskilt intressant i en klinisk miljö.
I detta papper illustrera vi därför culturing förfarandet för isolering och expansion av mänsklig benmärg-derived mesenkymala stromaceller (hBMSCs) och mänskliga dermal mikrovaskulära endotelceller (HDMECs) på kollagen-I-baserade rekombinant peptidbaserade microcarriers och deras förberedelser för leverans i en klinisk miljö. Dessutom beskriver vi tilläggsprotokollen användbar för underhåll av cellernas viabilitet vid implantation.
Cellernas viabilitet efter implantation är starkt beroende av vaskularisering15,16,17, vilket säkerställer utbytet av syre och näringsämnen och underlättar avfallshantering. Bioreaktorer utgör en metod för att övervinna vaskularisering utmaningar i vävnadsteknik och underhålla cellernas viabilitet, genom genomblödning av odlingsmedium som tillhandahåller därmed syre och näringsämnen18. Här, illustrera vi en in vitro- Metod för att utvärdera funktionen migration av mikrovaskulära endotelceller från den RCP microcarriers till en biomatrix och deras förmåga att bidra till de novo vaskularisering och angiogenes. Denna biomatrix är ett cell-lösa segment av svin jejunum kallas BioVaSc (biologiska vaskulariserad byggnadsställning), rik på kollagen och elastin och med bevarade vaskulära strukturer, som inkluderar en utfodring artär och en dränerande ven19 som har varit tillämpas för implantation problem20.
En huvudsakliga målet med microcarrier är en utbyggnad av celler samtidigt som deras differentiering för att kunna leverera celler till förlägga av behovet. Metoden representerade införa RCP microcarriers där celler kunde bifoga, föröka sig och kolonisera microcarriers med hög cell densiteten. Detta observerades av live/dead färgning, där mer än 90% av viabla celler upptäcktes medan endast några döda celler erhölls efter 7 dagar av dynamiska kulturer. Jämväl, SEM bilder bekräftade att cellerna täckte…
The authors have nothing to disclose.
Den forskning som leder till dessa resultat har fått finansiering från Europeiska unionens sjunde ram programmet FP7/2007 – 2013 enligt grant avtalet n ° 607051 (BIO-INSPIRE). Vi tackar Carolien van Spreuwel-Goossens från Fujifilm Manufacturing Europe B.V., för tekniskt bistånd under RCP tillverkning och Werner Stracke från Fraunhofer Institute för silikat forskning ISC, för hjälp med SEM analys.
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide (MTT) | Serva Electrophoresis GmbH | 20395.01 | |
4’,6-Diamidino-2-phenylindoldihydrochloride (DAPI) | Sigma-Aldrich | D9542 | |
Acetic acid 100% | Sigma-Aldrich | 533,001 | |
Analytical balance Kern EG 2200-2NM | Kern & Sohn GmbH | ||
Ascorbate-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | |
Bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
Bright field microscope Axiovert 40C | Carl Zeiss AG | ||
Cellnest | Fujifilm | ||
Centrifuge tubes (15 mL, 50 mL) | Greiner Bio-One | ||
Collagen R solution 0,4% | Serva Electrophoresis GmbH | 47254.01 | |
DMEM-F12 | Gibco | 11320-033 | |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich | D8537 | Modified, without calcium chloride and magnesium chloride |
Eosin 1% | Morphisto | 10177.01000 | |
Ethanol 96% | Carl Roth GmbH | T171.4 | Denatured |
Fetal calf serum (FCS) | Bio&SELL | FCS.ADD.0500 | not heat-inactivated |
Fluorescence microscope BZ-9000 | Keyence | ||
Haematoxylin | Morphisto | 10231.01000 | |
Hexamethyldisilazane | Sigma-Aldrich | 440191 | Reagent grade, ≥99% |
Incubator for bioreactor | Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine, Wuerzburg, Germany | ||
Live/Dead Cell Double Staining Kit | Fluka | 04511KT-F | |
Magnetic stirrer plate | 2Mag | 80002 | |
Medium 199 | Sigma-Aldrich | M0650 | 10X |
Microplate reader Tecan Infinite M200 |
Tecan | ||
Needle 21G 16mm | VWR | 613-5389 | |
Papain from papaya latex | Sigma-Aldrich | P4762 | lyophilized powder, ≥ 10 units/mg protein |
Paraffin | Carl Roth GmbH | 6642.6 | |
Penicillin/Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
Peristaltic pump | Ismatec | ||
Quanti-iT PicoGreen dsDNA assay kit | Thermo Fischer Scientific | P7589 | |
Histofix 4% | Carl Roth GmbH | P087 | |
Scanning Electron Microscope Supra 25 | Carl Zeiss AG | ||
Sodium hydroxide solution 1.0 N | Sigma-Aldrich | S2770 | |
Spinner flasks (25 mL) | Wheaton | 356879 | |
Syringe 1 mL | VWR | 720-2561 | |
Tissue culture flasks (25 cm2, 75 cm2, 150 cm2) | TPP Techno Plastik Products AG | ||
Trypan blue 0.4% | Sigma-Aldrich | T8154 | |
VascuLife VEGF-Mv | Lifeline cell technology | LL-0005 |