Summary
För närvarande är Immunofluorescerande färgning på fasta celler vald analysmetod för bestämning av protein uttryck nivåer när morfologisk information är också nödvändig. Detta protokoll som presenteras häri föreskrivs en alternativ metod för immuncytokemi på paraffin-inbäddat cell block.
Abstract
Immunofluorescerande färgning är för närvarande metoden för bestämning av protein uttryck nivåer i cellkultur system när morfologisk information är också nödvändig. Protokollet av immunocytochemical färgning på paraffin-inbäddat cell block, presenteras häri, är ett utmärkt alternativ till Immunofluorescerande färgning på icke-paraffin-inbäddat fast celler. I detta protokoll, ett paraffin cell block från HeLa cells var beredd med metoden thromboplastin-plasma och immuncytokemi utfördes för utvärdering av två markörer för spridning, CKAP2 och Ki-67. De kärnor och cytoplasmiska morfologi av HeLa cellerna var väl bevarad i de cell-block-bilderna. Samtidigt var CKAP2 och Ki-67 färgning mönstren i immuncytokemi ganska liknande dem i immunhistokemisk färgning i paraffin cancer vävnader. Med modifierad cell-kultur villkor, inklusive före inkubering av HeLa cells serumfritt villkor kunde effekten utvärderas samtidigt bevara arkitektoniska information. Sammanfattningsvis är immuncytokemi på paraffin-inbäddat cell block ett utmärkt alternativ till Immunofluorescerande färgning.
Introduction
I de flesta laboratorier används paraffin-inbäddat cell block vanligtvis inte. Snarare, fast odlade celler, inte paraffin-inbäddat celler, anställda i subcellulär lokalisering studier. För de fasta odlade celler, har fluorescens i stället för kromogen använts. Immunofluorescerande färgning är därför för närvarande vald analysmetod för bestämning av protein uttryck nivåer i forskning som sysselsätter cell kulturer1. Bilder förberedd för Immunofluorescerande färgning, kan dock observeras endast under Immunofluorescerande mikroskopi, som kan visa bilder helt annorlunda än de som anges under planet mikroskopi2. Dessutom bevarandet av diabilder för Immunofluorescerande färgning kräver skydd från ljus och fluorescerande signaler blir svagare med upprepad exponering för imaging på grund av förlusten av den fluorescerande signal3. Resultat från immuncytokemi på paraffin-inbäddat cell block är ganska lika de från immunohistokemi på paraffin-inbäddat vävnader4, och de kan enkelt översättas till klinisk information. Immuncytokemi kan därför vara ett utmärkt alternativ. Dock har cell-block beredning inte varit populära i grundläggande forskningslaboratorier. I detta protokoll, sedan ingår cell-block förberedelse och immunocytochemical färgning för att främja användningen av denna metod i fältet i cell-kultur och samhälle.
Cell-block förberedelse och immuncytokemi är inte unika metoder, och de har redan tillämpats från klinisk diagnos till grundforskning4,5. Även om olika cell-block förberedelse metoder har varit rapporterade4,är6 thromboplastin-plasma metoden enkel, kostnadseffektiv och lätt anpassningsbar. Därför i det protokoll som presenteras i detta papper, tromboplastintid-plasma metod4,5,6,7,används8 för beredning av paraffin-inbäddat cell block.
I den aktuella studien visades de detaljerade förfarandena för utarbetande av thromboplastin-plasma cell block och metoden immuncytokemi sysselsätter två spridning markörer. En markör är cytoskelettet-associerade protein 2 (CKAP2), som nyligen har rapporterats som en mitotiska markör9,10,11. den andra är Ki-67, som är den mest kända spridning marker12. Det representativa systemet visas i figur 1.
Protocol
Studieprotokollet godkändes av den institutionella i styrelsen av National Cancer Center, Korea (NCCNCS-12-630).
1. Provberedning (30 min)
- HeLa cells (CCL-2, ATCC) kultur, använda 10 mL komplett DMEM medium (10% fetalt bovint serum, 1% penna-strep) i en 100 mm kultur maträtt. För att förbereda serum-svalt HeLa cells, inkubera konfluenta HeLa cells i DMEM utan fetalt bovint serum i 48 timmar, som beskrivs i en tidigare studie11.
- För att lossa cellerna, tvätta dem med 2 mL fosfatbuffrad saltlösning (PBS), och tillsätt 2 mL 0,25% EDTA trypsin per 100 mm kultur maträtt. Sedan, inkubera i 2-3 min i en CO2 inkubator vid 37 ° C.
- Tillsätt 5 mL av komplett DMEM medium till kultur skålen att avaktivera trypsin och överföra fristående cellerna till en 15 mL tub. Sedan Centrifugera cellerna vid 300 x g i 10 min att bilda en pellet.
- Avlägsna supernatanten och tvätta pelleten två gånger med 2 mL kall PBS genom centrifugering vid 300 x g i 10 min.
- Efter avlägsnande av supernatanten, tillsätt 1 mL 95% etanol till cellpelleten och blanda cellpelleten med etanol genom vortexa. Hålla fast cellerna på is tills cellen-block beredning.
2. cell-block förberedelse (1 h 30 min)
- För beredning av färskfrusen plasma alikvoter, samla EDTA plasma från friska givare blod och centrifugera vid 13 000 x g i 10 min. samla supernatant plasma alikvot 200-400 µL varje i microfuge rör. Lagra alikvoter vid-80 ° C fram till användning. När de fryst plasmaalikvoter är redo, hämta dem och Tina plasma genom inkubation vid 37 ° C i 5 min.
- Centrifugera fast cellerna vid 700 x g i 10 min, sedan Kassera supernatanten.
- Blanda cellpelleten med 2 droppar (ca 200 µL) plasma, 2 droppar om tromboplastintiden och 2 droppar av 0,025 M kalciumklorid. Sedan blanda dem genom pipettering.
- Låt blandningen bildar en cell koagulera i rumstemperatur i 10 min, som visas i figur 2A. Sedan tvätta cell koagel med PBS två gånger genom att hälla och ta bort PBS med pipett. Representativa vita blodkroppar koagel visas i figur 2B.
- Fukta en bit av filterpapper med formalin, och Linda cell koagel med det pre-fuktad filterpappret. Sedan placera levrat blandningen med en pincette i en vävnad kassett som visas i figur 2 c.
- Plats vävnad kassetten i en glasburk innehållande 50 mL buffrad formalin (10% formalin i PBS) över natten vid 4 ° C för formalin fixering.
3. vävnad behandling och Paraffin inbäddning (natten)
- Ladda vävnad kassett som innehåller formalin-fasta cell koagel i en vävnadsprocessor övernattning som tidigare beskrivits11. På vävnad behandling är för vatten borttagning och konditionering av fasta celler före paraffin inbäddning. För forskning utan vävnad bearbetning, utföra vävnaden förädling som visas i tabell 1.
- Slå på den uppvärmda inbäddning station och 60 minuter senare, kolla att det finns smält paraffin i metall mögel däri (figur 2D).
- Ta bildade cell koagel från vävnad kassett och placera den i smält paraffinet inom metall mögel.
- Plats ny vävnad kassett utan lock i metall formen som innehåller cellen koagulera i mitten den smält paraffinen och häll mer smält paraffin i vävnad kassetten och på metall mögel. Sedan låta paraffinet stelna i den kalla plattan för 30-60 sekunder.
- Separata vävnad kassetten från metall mögel. Då är paraffin cell blocket redo för immuncytokemi. Inbäddade cell koagel i paraffin-inbäddat cell block indikeras av pilen i figur 2E.
4. beredning av diabilder för immuncytokemi (1 h)
- Kontrollera området för cell koagel i paraffin cell block och skär blocket cell i skivor med tjocklekar 3-4 µm med hjälp av en mikrotom. Sätta i paraffin avsnitt på silan-belagd glasskivor, som visas i figur 2F.
- Placera avsnitt glasen i en 37 ° C ugn i 30 min att göra avsnitten följer bilderna.
5. immuncytokemi Cell block (6 h)
Obs: För immunocytochemical färgning på cell-block sektioner, olika Kit kan användas (se Tabell för material). Alla sådana satser har olika känslighet och särdrag beroende på deras ändringar.
- Inkubera avsnitten i 50 mL xylen för 4 min till de paraffinize.
- Inkubera bilderna i 100% etanol för 2 min för uttorkning, och två gånger i 95% etanol, och i 80% etanol i 2 min. Ta sedan bort etanol i rinnande vatten i ca 10 min.
- För antigen retrieval, placera glasen i en burk innehållande 40 mL Tris-EDTA hämtning buffert, pH 9.0, och koka i en spis i 30 min.
- Tvätta bilderna under rinnande vatten och inkubera dem i 95% etanol under 10 minuter vid 4 ° C. Sedan, markera området cell-färgning på bilderna med en Pap-penna för enkel identifiering.
- Tvätta bilderna i Tris-buffrad saltlösning som innehåller 0,2% Tween-20 (TBS-T), och inkubera i blocket väteperoxid (se Tabell för material) i rumstemperatur i 15 min att ta bort någon kvarleva peroxidasaktiviteten. Tvätta sedan, bilderna i TBS-T tre gånger i 2 min varje.
- Förbereda utspädda antikropp lösning genom att späda ut primär antikropp i blocket protein (se Tabell för material). Exempelvis utspädd den CKAP2 primär antikropp kan vara 1: 100, och den Ki-67 antikropp 1: 500. Sedan, inkubera bilderna i 100 µL utspädda antikropp lösning för 1 h.
- Efter tvätt i TBS-T fem gånger i 2 min varje, inkubera bilder i den primära antikropp förstärkare i kit för 15 min i rumstemperatur i mörkret.
- Efter tvätten i TBS-T fyra gånger i 2 min varje, tillsätt 2 droppar av HRP polymer (en sekundär antikropp märkta med pepparrotperoxidas) och inkubera bilderna i rumstemperatur i 30 min.
- Efter tvätt i TBS-T fem gånger i 2 min varje, tillsätt 100 µL av Diaminobenzidin (DAB) lösning (se Tabell för material), och inkubera bilderna för 3 min.
- Efter tvättning i TBS-T två gånger, tillsätt 100 µL av Hematoxylin lösning (blandningen av 100 µL av Hematoxylin och 600 µL destillerat vatten), och inkubera bilderna för 1 min.
- Efter tvätt torkar glasen i TBS-T en gång, genom ruvning i 95% etanol i 2 min, doppa i 95% etanol en gång och doppa i 100% etanol två gånger. Sedan, inkubera bilder i 40 mL xylen i en glasburk i 5 min.
- När bilderna är torr från xylen, montera den respektive coverslips.
- Iaktta de färgning mönster med ljusmikroskop.
Representative Results
I en hematoxylin-och-eosin-färgade bild från blocket paraffin-inbäddat cellen (figur 3AB) är de flesta av atomkärnor och cytoplasman i celler intakt, vilket tyder på att morfologiska bevarandet är utmärkt med det aktuella protokoll ( Figur 3A). I den immunocytochemical färgning, observerades positiva CKAP2 färgning i sammandrag kromatin, mitotiska spindeln och cytoplasman (figur 4), som tidigare rapporterats10. KI-67 färgning observerades i cellkärnan, som beräknade (figur 4). Endast celler med CKAP2 färgning i sammandrag kromatin (se pilarna i figur 4AB) var mitotiska celler. Många CKAP2-positiva celler visades i de mycket mitotiska HeLa cells som hade upprättats efter en inkubation i komplett medium (figur 4A). I jämförelse fanns det några CKAP2-positiva celler i serum-svalt HeLa cellerna (figur 4B). De flesta av de mycket mitotiska HeLa cellerna var Ki-67 positiva (figur 4 c). Contrastingly, Ki-67-positiva i serum-svalt HeLa celler varit så hög som ~ 50% (figur 4 d). Dessa resultat är ganska jämförbara med en tidigare rapport11, som tyder på att CKAP2 är en mer tillförlitlig spridning markör i cancerceller än är Ki-67.
Atomkärnor skiljs från cytoplasman i dåligt förberedda cell block, och det finns också, resultantly, dålig morphologic bevarande. Längre-än-natten inkubation av fasta celler i kylskåp kan orsaka sådana dåliga resultat. Ett annat viktigt problem är att cellerna inte färgas väl genom immuncytokemi, trots utmärkt morfologi. Det här problemet uppstår oftare när cellen koagel är liten. Färgning intensiteten är vanligtvis oregelbundna som visas i figur 3B; men när cellen koagel är större, det finns mycket mindre chans att oregelbundna fläckar. Därför, i detta protokoll, vi ökade volymerna av plasma, tromboplastintid och kalciumklorid för att bilda en stor cell propp.
Figur 1: Cell-block förberedelse scheme. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Illustration av paraffin cell-block förberedelse. (A) thromboplastin-plasma cell propp i röret. (B) TP Cell blodpropp efter PBS tvätt. (C) Cell propp på fuktade filterpapper. (D) vävnad-inbäddning station med smält vax. Metall mögel (pil) innehar smält vax för stel. (E) paraffin-inbäddat cell koagel (pil) inbäddad i paraffin eller paraffin-inbäddat cell block. (F) tunn paraffin avsnitt på den mellersta delen av en täckt glidbana. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Cell-block förberedelse och bekräftelse av kvalitet av hematoxylin och eosin och immunfärgning. (A) hematoxylin-och-eosin-målat bilden av HeLa celler i ett paraffin-inbäddat cell-block-avsnitt. (B) oregelbundna färgning Ki-67 i immuncytokemi på en dåligt förberedd paraffin-inbäddat cell-block avsnitt. Skala barer är (A) 100 och (B) 200 μm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Immunocytochemical färgning på paraffin-inbäddat cell block för HeLa cells. (A) CKAP2 färgning mycket mitotiska villkor. (B) CKAP2 färgning serum-svalt villkor. (C) Ki-67 färgning mycket mitotiska villkor. (D) Ki-67 färgning serum-svalt villkor. 100 μm skala bar visas. Pilspetsar visar CKAP2-positiva celler. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| Förfarande | Steg | Lösning | Tid och temperatur |
| Dehydrering | 1 | 70% alkohol | 15 min/RT |
| 2 | 80% alkohol | 15 min/RT | |
| 3 | 95% alkohol | 15 min/RT | |
| 4 | 100% alkohol | 15 min/RT | |
| Rensa | 1 | Xylen | 60 min/4 ° C |
| 2 | Xylen | 10 min/RT | |
| 3 | Xylen | 10 min/RT | |
| 4 | Xylen | 10 min/RT | |
| * RT, rumstemperatur |
Tabell 1. Vävnaden förädling.
Discussion
Immunofluorescerande färgning på fasta odlade celler är för närvarande metoden för bestämning av protein uttryck nivå i celler samtidigt bevara morfologisk information1. Immuncytokemi på paraffin-inbäddat cell block kan dock vara ett utmärkt alternativ. De detaljerade förfarandena för utarbetande av paraffin-inbäddat cell block och immuncytokemi har beskrivits i detta protokoll, och vi hoppas det kan underlätta tillämpningen av immuncytokemi i cellstudier.
Immuncytokemi har flera fördelar över Immunofluorescerande färgning. Immunofluorescerande färgning för celler vanligtvis kräver färska odlade celler, men cellen paraffinblock kan förvaras i rumstemperatur i flera år13. Dessutom kan immuncytokemi på cell block utforska intracellulära uttrycksmönster anställa samma antikropp används i rutinmässiga immunohistokemi på mänskliga vävnader4. Det dessutom kan utforska förändringarna i proteinnivåer eller posttranslationell ändringar antingen genom före ruvning celler med olika droger eller under olika kultur villkor11.
I motsats till fördelarna med immunocytochemical färgning, beredning av paraffin-inbäddat cell block tar tid och är kostsamt14. Även de flesta forskningslaboratorier saknar erfarenhet i denna teknik och tekniska fel under sådana omständigheter är vanliga. De vanligaste felen är dålig bevarandet av cellmorfologi och dålig eller oregelbundna immunocytochemical färgning på avsnitten paraffin cell block. Dessa och de flesta andra kan undvikas genom att göra cell block under bästa cell och använda tillräckligt lösning för att bilda cell blodproppar.
Som en demonstration av detta protokoll, cell block var förberedda för HeLa cells och immunocytochemical färgning utfördes för två markörer för spridning, CKAP2 och Ki-67, som tidigare rapporterats11. Cellerna var manipulerade genom inkubation i media med och utan fetalt bovint serum immuncytokemi, och effekten av serum svält kunde observeras. Dessa beredda paraffin-inbäddat cell block kan användas för ett stort antal antikroppar, eftersom många bilder kan framställas från en cell block med endast en 4-5 µm tjock cell-block avsnitt per bild. Uttrycksmönster motsvarar två olika villkor kan därför utvärderas med flera olika antikroppar. Immunfärgning mönster för CKAP2 och Ki-67 i cancer vävnader har redan rapporterat9,10,11,12, och den immunocytochemical färgning resultat kunnat utvärderas enkelt, eftersom den färgning mönster var ganska liknande till de från immunohistokemi.
Avslutningsvis kan immunocytochemical färgning på paraffin cell block vara ett utmärkt alternativ till Immunofluorescerande färgning; Dessutom, det kan vara enkelt och pålitligt anställd i grundforskning för uttryck profilering i cellinjer samtidigt bevara morfologisk information.
Disclosures
Alla författare har förklarat inga intressekonflikter.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av forskningsanslag till K.-M.H. från National Cancer Center, Korea (1510121) och National Research Foundation, Korea (nr. NRF-2015R1A2A2A04007432).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HeLa Cells | ATCC | HeLa (ATCC CCL-2) | |
| Ki-67 Antibody | Thermo Fisher Scientific | RM-9106-S1 | |
| Paraffin | Leica | 39601006 | |
| Xylene | Fisher SCientific | 1330-20-7,100-41-4 | |
| Ethenol | GD Chem | DJ16016 | |
| Hematoxylin | Agilent | 10118581 | |
| DAB Quanto Kit | Thermo Fisher Scientific | TA-125-QHDX, QHCX 170405 | |
| Ultravision LP detection Kit | Thermo Fisher Scientific | PBQ141209, LPB141209, LPH141210 | Kit for immunocytochemistry; contains protein block |
| TintoRetriever Pressure Cooker | Bio SB Corporation | BSB 7008 | |
| Tris-buffered saline | iNtRON Biotechnology | IBS-BT008 | |
| Tween 20 | USB Corporation | 115106 | |
| Thromboplastin | Neoplastin Cl Plus | NC0591432 | |
| Tris-EDTA retrival Buffer | Dignostic Biosystem | E625-A | |
| Trypsin EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone Laboratories Inc | SH30910.03 | |
| DMEM | Hyclone Laboratories Inc | SH30243.01 | |
| Antibiotic-Antimycotic, 100X | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| Ultra vision peroxide block H2O2 | Thermo Fisher Scientific | 02Q141212 | |
| Mounting Medium | Thermo Fisher Scientific | 363313 | |
| Pap-Pen | Vector Laboratories | H-4000 | |
| Filter Paper | GE Healthcare Life Sciences | 1001-0155 | |
| Calcium Chloride | Sigma-Aldrich | 21115-100ml | |
| Phosphate-buffered saline | PAA Laboratories | H21-002 | |
| Formalin | Daejung | 50-00-0 | |
| 15 ml tube | SPL Life Sciences | 50015 | |
| tissue processing cassette | Simport | M492-5 | |
| 100 mm culture dishes | BD Biosciences | 08-772E | |
| Glass Slide | Muto Pure Chemicals | 140712 | |
| Cover Glass | Marienfeld | 2262817 | |
| Glass Zar | Hyunil Lab-Mate | HIP-1027 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Class II Laminar Flow Hood | Thermo Fisher Scientific | 1300 series A2 | |
| CO2 Incubator | Thermo Fisher Scientific | Series A2 | |
| Tissue Processor | Leica BioSystem | TP1020 | |
| Microtome | Thermo Fisher Scientific | HM340E | |
| Microscope | Olympus | CX-21 | |
| Paraffin embedding station | Thermo Fisher Scientific | EC 350-1, EC 350-2 | |
| Tissue Section Bath (Round) | CellPath | HCP-JAW-0100-00AEU | |
| Fume Hood | Hanyang Scientific Equipment Co. Ltd. | FH-150 |
References
- Bhattacharyya, D., Hammond, A. T., Glick, B. S. High-quality immunofluorescence of cultured cells. Methods Mol Biol. 619, 403-410 (2010).
- Brown, C. M. Fluorescence microscopy - Avoiding the pit falls. J Cell Sci. 120, 1703-1705 (2007).
- Odell, I. D., Cook, D. Immunofluorescence Techniques. J Invest Dermatol. 133, e4 (2013).
- Kulkarni, M. B., Desai, S. B., Ajit, D., Chinoy, R. F. The utility of the thromboplastin-plasma cell-block technique for fine-needle aspiration and serous effusions. Diagn Cytopathol. 37 (2), 86-90 (2009).
- Shivakumarswamy, U., Arakeri, S. U., Karigowdar, M. H., Yelikar, B. Diagnostic utility of the cell block method versus the conventional smear study in pleural fluid cytology. J Cytol. 29 (1), 11-15 (2012).
- Nathan, N. A., Narayan, E., Smith, M. M., Horn, M. J. Cell block cytology: Improved preparation and its efficacy in diagnostic cytology. Am J Clin Pathol. 114 (4), 599-606 (2000).
- Keyhani-Rofagha, S., Vesey-Shecket, M. Diagnostic value, feasibility, and validity of preparing cell blocks from fluid-based gynecologic cytology specimens. Cancer. 96, 204-209 (2002).
- Young, N. A., Naryshkin, S., Katz, S. M. Diagnostic value of electron microscopy on paraffin-embedded cytologic material. Diagn Cytopathol. 9, 282-290 (1993).
- Jin, Y., Murakumo, Y., Ueno, K., Hashimoto, M., Watanabe, T., Shimoyama, Y., et al. Identification of a mouse cytoskeleton-associated protein, CKAP2, with microtubule-stabilizing properties. Cancer Sci. 95 (10), 815-821 (2004).
- Hong, K. U., Choi, Y. -B., Lee, J. -H., Kim, H. -J., Kwon, H. -R., Seong, Y. -S., et al. Transient phosphorylation of tumor associated microtubule associated protein (TMAP)/cytoskeleton associated protein 2 (CKAP2) at Thr-596 during early phases of mitosis. Exp Mole Med. 40, 377-386 (2008).
- Sim, S. H., Bae, C. D., Kwon, Y., Hwang, H. -L., Poojan, S., Hong, H. -I., et al. CKAP2 (cytoskeleton-associated protein2) is a new prognostic marker in HER2-negative luminal type breast cancer. PLoS ONE. 12 (8), e0182107 (2017).
- Inwald, E. C., Klinkhammer-Schalke, M., Hofstadter, F., Zeman, F., Koller, M., Gerstenhauer, M., et al. Ki-67 is a prognostic parameter in breast cancer patients: results of a large population-based cohort of a cancer registry. Breast Cancer Res Treat. 139 (2), 539-552 (2013).
- Katikireddy, K. R., O'Sullivan, F. Immunohistochemical and immunofluorescence procedures for protein analysis. Methods Mol Biol. 784, 155-167 (2011).
- Beutner, E. H. Immunofluorescent staining: The fluorescent antibody method. Microbiol Mol Biol Rev. 25 (1), 49-76 (1961).
