Fabbricazione di una matrice di multiplex artificiale microambiente cellulare
Summary
Questo articolo descrive la metodologia dettagliata per preparare una matrice Multiplexed artificiale microambiente cellulare (MACME) per manipolazione di alto-rendimento di fisica e chimica di stecche che imita in vivo cellulare microambienti e a identificare l’ambiente cellulare ottima per le cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) con l’analisi di singole cellule.
Abstract
Microambienti cellulari consistono di una varietà di segnali, quali fattori di crescita, matrici extracellulari e interazioni intercellulari. Questi spunti sono ben orchestrati e sono fondamentali nella regolazione di funzioni cellulari in un sistema vivente. Anche se un numero di ricercatori hanno tentato di studiare la correlazione tra fattori ambientali e funzioni cellulari desiderate, molto rimane sconosciuto. Questo è in gran parte a causa della mancanza di una corretta metodologia di imitare tali stimoli ambientali in vitroe testare simultaneamente diversi stimoli ambientali sulle cellule. Qui, segnaliamo una piattaforma integrata di canali microfluidici e una matrice di nanofibra, seguita da analisi unicellulare ad alto contenuto, per esaminare i fenotipi di cellule staminali alterati da fattori ambientali distinti. Per illustrare l’applicazione di questa piattaforma, questo studio si concentra sui fenotipi di autorinnovanti cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs). Qui, presentiamo le procedure di preparazione per una matrice di nanofibra e la struttura di microfluidica nella fabbricazione di una matrice di Multiplexed artificiale microambiente cellulare (MACME). Inoltre, procedura generale della singolo-cella profilatura, con marcatori fluorescenti multiple, multiple imaging di fluorescenza e analisi statistiche, di colorazione cellulare è descritti.
Introduction
Pluripotenti umane cellule staminali (hPSCs)1,2 auto-rinnovarsi illimitatamente e differenziare in varie linee cellulari del tessuto, che potrebbero rivoluzionare lo sviluppo di farmaci, terapie basate su cellule, ingegneria tissutale e medicina rigenerativa 3 , 4 , 5 , 6. cultura generale piatti e piastre di microtitolazione, tuttavia, non sono progettati per consentire la manipolazione precisa delle cellule fisiche e chimiche a livello cellulare con la gamma di nano – per micrometri, che è un fattore critico per l’espansione cellulare, auto-rinnovamento e differenziazione. Per risolvere questo inconveniente, studi hanno studiato i ruoli di microambienti cellulari nella regolazione decisioni di destino delle cellule e cellula funzioni4. Negli ultimi anni, un numero crescente di studi è stati condotti per ricostruire microambienti cellulari in vitro7,8. Processi di nano – e micro-fabbricazione hanno stabilito questi microambienti attraverso la manipolazione chimica9,10,11,12,13, 14,15,16,17 e stimoli ambientali fisici18,19,20 . Fino ad ora, c’erano rapporti di indagare sistematicamente i meccanismi di fondo di stimoli ambientali chimici e fisici sulle decisioni di destino delle cellule e funzioni all’interno di una singola piattaforma.
Qui, presentiamo una strategia basata sui principi di progettazione semplice per stabilire una piattaforma di screening robusto (Figura 1). In primo luogo, descriviamo la procedura di sviluppo di una piattaforma integrata per la creazione di microambienti cellulare versatile, artificiale utilizzando una matrice di nanofibra e una struttura di microfluidica: matrice di The Multiplexed artificiale cellulare microambiente (MACME) (Figura 1A e 2A). La matrice di nanofibra ha 12 differenti microambienti in diverse combinazioni di materiali nanofibra e densità. Elettrofilatura è stato usato per fabbricare le nanofibre. I materiali di nanofibra, quali polistirolo (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22e gelatina (GT)23, sono stati progettati per testare le loro proprietà chimiche, che possono pregiudicare adesione cellulare e mantenimento della pluripotenza ( Figura 2B). Nanofibra densità sono state variate cambiando tempo elettrofilatura e le nanofibre generate sono state definite secondo la loro densità (DNF, con D = XLow/bassi/medi/alti). La struttura di microfluidica è composta di polidimetilsilossano (PDMS) che harboring 48 alloggiamenti di coltura cellulare, che possono essere posizionate lungo le dimensioni standard della micropiastra 96 pozzetti. PDMS è un polimero biocompatibile e gas-exchangeable generalmente usato per fabbricare di dispositivi microfluidici24. Ogni canale di microfluidica è stato progettato per essere 700 µm di larghezza e 8,4 mm lungo e aveva due ingressi ai relativi bordi (tabella 1). La chambers ebbe diverse altezze (250, 500 e 1000 µm) per manipolare le densità iniziale delle cellule-semina (0.3, 0.6 e 1.2 × 105 cellule/cm2), che potrebbero correlare con la sopravvivenza, proliferazione e differenziazione di hPSCs25 (Figura 2C). Il numero delle cellule seminate in una camera è proporzionale alla densità di colonna sopra il pavimento di camera, e così semina la densità iniziale delle cellule era controllata introducendo la stessa sospensione di cellule in alloggiamenti di cultura con diverse altezze. Tutti i canali sono stati progettati per essere ≥ 250 µm-altezza26 per minimizzare gli effetti di tensione basso ossigeno27 e shear stress28 sulle cellule. Altezze di canale di 250, 500 e 1000 µm sono abbreviate qui come XCD con X = Low, Mid e High, rispettivamente. Gli ambienti con nanofibra distinte densità e densità di semina delle cellule iniziali sono stati accorciati come “Material_NF density_Cell densità” (ad es., GT_HighNF_HighCD: un ambiente caratterizzato da nanofibre GT ad alta densità e alta cella-seeding iniziale densità).
Successivamente, descriviamo come eseguire analisi unicellulare per studiare sistematicamente il comportamento delle cellule in risposta a fattori ambientali (Figura 1B). Come un proof-of-concept, abbiamo identificato l’ambiente cellulare ottima per hPSC auto-rinnovamento, che è una funzione chiave per hPSC manutenzione (Figura 1B)29. Basata su immagine cytometry, seguita da analisi statistiche, consente di interpretazione quantitativa delle singole risposte cellulari fenotipiche agli ambienti cellulari. Tra una varietà di funzioni cellulari, questo libro fornisce una procedura dettagliata per individuare le condizioni ottimale per il mantenimento di hPSC auto-rinnovamento.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo viene illustrato il primo metodo di screening per stabilire un sistema di cultura robusta per la manutenzione di hPSCs qualificato. In primo luogo, abbiamo descritto come preparare una piattaforma con diversi ECMs artificiale e densità di semina utilizzando un dispositivo microfluidico integrato con una matrice di nanofibra, la matrice MACME cellulare. Secondo, quantitativa basata su immagine unicellulare phenotyping era eseguita50 per valutare risultati cellulari individuali e …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo la Prof. ssa N. Nakatsuji alla iCeMS, Università di Kyoto, per la fornitura di cellule umane ES. Ringraziamo anche la Prof. ssa A. Maruyama Tokyo Institute of Technology per il suo sostegno nell’uso del microscopio a forza atomica. Finanziamento è stato generosamente fornito dalla società Giappone per la promozione della scienza (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 e 24656502); finanziamento è stato fornito anche dalla nuova energia e organizzazione di sviluppo industriale tecnologia (NEDO) e la Fondazione di Life Science di Terumo. Il WPI-iCeMS è supportato da mondo Premier International Research Centre iniziativa (WPI), il Ministero della pubblica istruzione, cultura, sport, scienza e tecnologia (MEXT), Giappone. Una parte di questo lavoro è stata supportata da Kyoto University Nanotechnology Hub e l’impianto di Nano-elaborazione AIST in “Progetto di piattaforma nanotecnologie” sponsorizzato da MEXT, Giappone.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
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