Изготовление мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения массива
Summary
Эта статья описывает подробная методология подготовить массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME) для манипуляции высок объём физико-химические сигналы подражая в vivo сотовой микросреды и Определите оптимальные клеточной среды для человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs) с одной ячейкой профилирования.
Abstract
Сотовый микросреды состоят из различных сигналов, таких как факторы роста, внеклеточной матрицы и межклеточных взаимодействий. Эти сигналы являются хорошо организованы и имеют решающее значение в регуляции функций клеток в живых систем. Хотя ряд исследователей пытались исследовать взаимосвязь между экологическими факторами и желаемого клеточных функций, многое остается неизвестным. Это во многом обусловлено отсутствием надлежащей методологии имитировать такие экологические сигналы в пробирке, и одновременно проверить различные экологические сигналы на клетки. Здесь мы приводим интегрированной платформы microfluidic каналов и массив нановолокно, следуют высоким содержанием одноклеточных анализа, для изучения стволовых клеток фенотипов, изменено, различных экологических факторов. Чтобы продемонстрировать применение этой платформы, это исследование посвящено фенотипов самостоятельного обновления человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs). Здесь мы представляем процедуры подготовки нановолокно массив и структуру microfluidic в изготовление массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME). Кроме того описаны общие шаги одной ячейки, профилирование, клетки, окрашивание с несколькими флуоресцентные маркеры, несколько изображений флуоресценции и статистического анализа.
Introduction
Человеческих плюрипотентных стволовых клеток (hPSCs)1,2 самостоятельно продлевать неограниченно и дифференцироваться в различные ткани линий, которые могут революционизировать разработки лекарственных средств, на основе ячеек терапии, тканевой инженерии и регенеративной медицины 3 , 4 , 5 , 6. Общая культура блюда и микротитровальных пластин, однако, не предназначены для включения точные физические и химические Сотовый манипуляции на клеточном уровне с диапазоном от nano – для микро метров, который является критическим фактором для сотовых расширения, самообновления и дифференциации. Чтобы устранить этот недостаток, исследования изучили роль клеточных микросреды в регулировании клеток судьба решения и функции клеток4. В последние годы все большее число исследований были проведены реконструировать сотовой микросреды в vitro7,8. Нано – и микро изготовление процессы создали эти микросреды через манипуляции химических9,10,11,12,13, 14,,1516,17 и физической18,19,20 экологические сигналы. До сих пор не поступало систематически расследовать основных механизмов химических и физических экологических сигналы на решений клеток судьба и функций в рамках единой платформы.
Здесь мы представляем стратегию, основанную на принципах простой дизайн для создания надежного скрининга платформы (рис. 1). Во-первых, мы описываем порядок разработки интегрированной платформы для создания универсальный, искусственные сотовой микросреды, используя массив нановолокно и структуру microfluidic: массив мультиплексированных искусственных сотовой микроокружения (MACME) (Рис. 1A и 2A). Нановолокно массив имеет 12 различных микросреды в разных сочетаниях нановолокно материалов и плотности. Electrospinning была использована для изготовления нановолокон. Нановолокно материалов, таких, как полистирол (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22и23желатин (GT), были разработаны для проверки их химические свойства, которые могут повлиять на клеточной адгезии и поддержания плюрипотентности ( Рисунок 2B). Нановолокно плотности были разнообразны, изменяя время electrospinning и сгенерированный nanofibers были определены согласно их плотности (DNF, с D = XLow/низкий/средний/высокий). Microfluidic структура состоит из укрывательство 48 камеры в культуре клеток, которые могут быть расположены вдоль стандартные размеры 96-луночных микропланшетов полидиметилсилоксан (PDMS). PDMS — обычно используется для изготовления microfluidic приборы24биосовместимых и газ сменный полимер. Каждый канал microfluidic был разработан чтобы быть 700 мкм широкий и 8.4-мм длиной и имел два отверстия на его краях (Таблица 1). Камеры были разной высоты (250, 500 и 1000 мкм) для манипулирования первоначального заполнения ячейки плотности (0,3 0,6 и 1.2 × 105 клеток/см2), которые можно соотнести с выживания, пролиферации и дифференцирования hPSCs25 (Рис. 2C). Количество ячеек в камеру семенами пропорциональна плотности столбца над полом камеры, и таким образом первоначальная клеточная посева плотность контролировался путем введения же суспензию клеток в культуре камер с разных высот. Все каналы были призваны быть ≥ 250 мкм высотой26 для сведения к минимуму воздействия напряжения низкой кислорода27 и касательное напряжение28 на клетки. Канал высот 250, 500 и 1000 мкм сокращенно здесь как XCD с X = низкий, Mid и высокий, соответственно. Средах с собственный нановолокно и первоначальный плотностью заполнения ячейки были укорочены как «Material_NF density_Cell» (например, GT_HighNF_HighCD: окружающей среды, характеризуется высокой плотностью GT нановолокон и высокой начального заполнения ячейки плотность).
Впоследствии мы описывают, как выполнять анализ одноклеточных систематически расследовать поведение клеток в ответ на экологические факторы (рис. 1Б). Как доказательство концепции мы определили оптимальные клеточной среды для hPSC самообновлению, который является одной из ключевых функций для hPSC обслуживание (рис. 1Б)29. На основе образа цитометрии, следуют статистического анализа, позволяет для количественной интерпретации отдельных клеточных реакций фенотипические клеточной среде. Среди различных клеточных функций этот документ содержит подробные процедуры для выявления оптимальных условий для поддержания hPSC самообновлению.
Protocol
Representative Results
Discussion
Этот протокол демонстрирует первый метод скрининга для создания системы надежных культуры для поддержания квалифицированных hPSCs. Во-первых мы описали как подготовить платформу, показывая различные искусственные ECMs и клеток, заполнение плотности, используя microfluidic устройства, интегри?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим проф. н. Nakatsuji iCeMS, Университет Киото, для обеспечения человеческих клеток ES. Мы также благодарим профессора A. Маруяма в Токийском технологическом институте за его поддержку в использовании атомно-силового микроскопа. Щедро финансировались японского общества для содействия развитию науки (страниц JSP; 22350104, 23681028, 25886006 и 24656502); финансирование было также предоставлено новой энергии и организация развития промышленных технологий (NEDO) и Фондом Terumo науки о жизни. WPI-iCeMS поддерживается мир премьер международного исследовательский центр инициативы (ИЗВ), Министерство образования, культуры, спорта, науки и техники (МПКСНТ), Япония. Часть этой работы была поддержана центром нанотехнологий университета Киото и аист нано-перерабатывающего завода в «Нанотехнологии платформы проекта «авторами МПКСНТ, Япония.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
References
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
