आरएनए हस्तक्षेप के व्यावहारिक उपयोग: तिलचट्टे के लिए Liposome वाहक में डबल कतरा आरएनए के मौखिक वितरण
Summary
इस पांडुलिपि liposomes में समझाया डबल असहाय आरएनए के मौखिक घूस के माध्यम से जर्मन तिलचट्टा के midgut में जीन अभिव्यक्ति की कमी को दर्शाता है ।
Abstract
आरएनए हस्तक्षेप (RNAi) व्यापक रूप से कई जीनों के जैविक कार्यों को उजागर करने के लिए लागू किया गया है, और एक कीट नियंत्रण आवश्यक जीन अभिव्यक्ति के विघटन द्वारा संचालित उपकरण के रूप में परिकल्पना की गई है । हालांकि इंजेक्शन के रूप में विभिंन तरीकों, खिला, और भिगोने, डबल असहाय आरएनए (dsRNA) के सफल वितरण के लिए सूचित किया गया है, dsRNA के मौखिक वितरण के माध्यम से RNAi की दक्षता विभिंन कीट समूहों के बीच अत्यधिक परिवर्तनशील है । जर्मन तिलचट्टा, Blattella germanica, dsRNA के इंजेक्शन के लिए अत्यधिक संवेदनशील है, के रूप में कई पहले प्रकाशित अध्ययनों से दिखाया गया है । वर्तमान अध्ययन एक विधि का वर्णन करने के लिए प्रदर्शित करता है कि dsRNA liposome वाहक के साथ समझाया midgut रस से dsRNA के क्षरण मंदबुद्धि के लिए पर्याप्त है । विशेष रूप से, dsRNA के निरंतर खिला liposomes द्वारा समझाया काफी midgut में tubulin अभिव्यक्ति कम कर देता है, और तिलचट्टे की मौत के लिए नेतृत्व किया । निष्कर्ष में, dsRNA lipoplexes के निर्माण और उपयोग, जो nucleases के खिलाफ dsRNA की रक्षा, भविष्य में कीट कीट नियंत्रण के लिए RNAi का व्यावहारिक उपयोग हो सकता है ।
Introduction
RNAi एक के बाद एक तंत्र के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति पछाड़ना के लिए एक प्रभावी विधि के रूप में प्रदर्शन किया गया है transcriptional मुंह बंद करने मार्ग कई dsRNA में eukaryotes अणुओं द्वाराट्रिगर1 । अध्ययन के पिछले एक दशक से अधिक, RNAi एक उपयोगी उपकरण के लिए विकास से जीन के कार्यों का अध्ययन करने के लिए इंजेक्शन और कीड़े के विभिंन taxa में dsRNA के द्वारा विशिष्ट जीन की अभिव्यक्ति घट द्वारा व्यवहार करने के लिए हो गया है2,3। घट रहे प्रभाव की विशिष्टता और मजबूती के कारण वर्तमान में RNAi के आवेदन को कीट नियंत्रण प्रबंधन4,5के लिए संभावित रणनीति के रूप में माना जा रहा है । हालांकि, RNAi की दक्षता कीट प्रजातियों के बीच व्यापक रूप से बदलता है, अलग जीन लक्षित किया जा रहा है और वितरण के तरीकों पर निर्भर करता है । सबूत के एक बढ़ती शरीर पता चलता है कि dsRNA, जो ribonucleases द्वारा अपमानित है की अस्थिरता, RNAi5,6की सीमित प्रभावकारिता में एक महत्वपूर्ण कारक है । उदाहरण के लिए, Manduca sexta में कम RNAi संवेदनशीलता तथ्य यह है कि dsRNA hemolymph के साथ मिश्रित जल्दी से 1 घंटे7के भीतर अपमानित किया गया था द्वारा समझाया गया है । इसी तरह, midgut में क्षारीय nucleases की उपस्थिति, जो कुशलता से नीचा dsRNAed, विभिन्न कीट आदेश में कम RNAi दक्षता के साथ दृढ़ता से संबंधित है8,9,10.
dsRNA के मौखिक वितरण एक कीट नियंत्रण रणनीति में RNAi के आवेदन के लिए विशेष रूप से दिलचस्प है, लेकिन एक विधि midgut में nucleases द्वारा dsRNA की गिरावट मंदबुद्धि अभी तक विकसित नहीं किया गया है, जो क्षमता को प्रभावी सुनिश्चित करने के लिए होगा RNAi के माध्यम से खिला । हालांकि, dsRNA की मौखिक प्रसव के लिए RNAi की प्रतिक्रिया dsRNA की बड़ी मात्रा में खिलाने के द्वारा सूचित किया गया है, जैसे Bombyx मोरीमें ५० µ जी, या लगातार 8 दिनों के लिए खिला (8 µ जी dsRNA कुल में) locust प्रजातियों में । जर्मन तिलचट्टा, Blattella germinica, dsRNA11,12,13,14के इंजेक्शन द्वारा RNAi के लिए अत्यधिक संवेदनशील है, लेकिन खिलाने के माध्यम से dsRNA के लिए उत्तरदायी नहीं है । हाल ही में, लिन एट अल । (२०१७) ने दिखा दिया है कि dsRNA सफल RNAi में liposome वाहक परिणामों के साथ encapsulated को α में tubulin -midgut जीन अभिव्यक्ति पछाड़ना और ट्रिगर जर्मन तिलचट्टा15के महत्वपूर्ण मृत्यु दर । midgut में dsRNA के क्षरण के रूप में मौखिक RNAi के लिए सीमित कारक है, liposome वाहक एक वाहन के रूप में क्षरण से dsRNA की रक्षा के लिए, जो पेट में मजबूत nuclease गतिविधियों के साथ अन्य कीड़ों में आसानी से लागू है की सेवा है । नोट की, विशेष अभिकर्मक एजेंट को चुनने के लिए कारण ( सामग्री की तालिकादेखें) हम वर्तमान प्रोटोकॉल में liposome वाहक के रूप में इस्तेमाल किया है कि यह कीट सेल लाइन अभिकर्मक कम विषाक्तता के साथ के लिए परीक्षण किया गया है, के अनुसार निर्माता के निर्देश । Gharavi एट अल में अलग liposome अभिकर्मक प्रणालियों की तुलना के अनुसार । (२०१३) 16, transfecting छोटे हस्तक्षेप आरएनए (सिरना) की दक्षता लगभग एक ही है कि अन्य कीड़ों में dsRNA वितरण प्रणालियों के लिए इस्तेमाल किया गया है इस और अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रणालियों के बीच17,18 . इसके अलावा, हमारे खिला विधि dsRNA की उचित मात्रा में प्रत्येक तिलचट्टा द्वारा घूस लेना सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त सावधान है, और है कि परिणाम मजबूत और पुष्टि कर रहे हैं । सारांश में, वर्तमान प्रोटोकॉल और परिणाम प्रदर्शित करता है कि dsRNA lipoplexes का उपयोग dsRNA स्थिरता में सुधार और रणनीति मौखिक डिलीवरी के डिजाइन के लिए दरवाजे खोलता है RNAi, जो भविष्य में कीट नियंत्रण के लिए एक आशाजनक दृष्टिकोण है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
इस प्रोटोकॉल dsRNA lipoplexes के मौखिक प्रसव के माध्यम से प्रभावी RNAi के लिए एक विधि प्रस्तुत करता है, जर्मन तिलचट्टा के midgut के रस में ribonuclease पाचन के खिलाफ संरक्षण शामिल । के रूप में विभिंन कीट प्रजातियों में अंय अध्यय…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन के ताइवान (विज्ञान और प्रौद्योगिकी मंत्रालय से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था, सबसे ज्यादा 100-2923-बी-002-002-MY3 और 106-2313-बी-002-011-MY3 से H.J.L.), चेक गणराज्य (साउथ बोहेमिया यूनिवर्सिटी की ग्रांट एजेंसी, गाजू ग्रांट 065/2017/पी टू वाइ. एच. एल.), और स्पेन ( स्पेनी अर्थव्यवस्था और प्रतिस्पर्धा के मंत्रालय, अनुदान CGL2012-36251 और CGL2015-64727-पी X.B. के लिए, और कातालान सरकार, अनुदान २०१४ SGR ६१९ को X.B.); इसके साथ ही आर्थिक और क्षेत्रीय विकास के लिए यूरोपीय कोष से वित्तीय सहायता (FEDER फंड्स टू X.B.) भी प्राप्त हुई ।
Materials
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
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