Praktisch gebruik van RNA-interferentie: mondelinge levering van Double-stranded RNA in liposomen dragers voor kakkerlakken
Summary
Dit manuscript toont de uitputting van de genexpressie in de middendarm van de Duitse kakkerlak via orale inname van double-stranded RNA ingekapseld in liposomen.
Abstract
RNA-interferentie (RNAi) is algemeen toegepast voor het blootleggen van de biologische functies van talrijke genen, en als een pest control tool operationele door verstoring van essentiële genexpressie is overwogen. Hoewel verschillende methoden, zoals injectie, voeding en inweken, hebben gemeld voor de succesvolle levering van double-stranded RNA (dsRNA), is de efficiëntie van RNAi via mondelinge levering van dsRNA zeer variabel tussen verschillende groepen van insecten. De Duitse kakkerlak, Blattella germanica, is zeer gevoelig voor de injectie van dsRNA, zoals blijkt uit de vele studies die eerder zijn gepubliceerd. De huidige studie beschrijft een methode om aan te tonen dat de dsRNA ingekapseld met liposoom dragers voldoende is om de afbraak van dsRNA retard door middendarm SAP. Met name de doorlopende invoer van dsRNA ingekapseld door liposomen aanzienlijk vermindert de tubuline expressie in de middendarm, en leidde tot de dood van kakkerlakken. Kortom, zou de formulering en het gebruik van dsRNA lipoplexes, die tegen nucleasen dsRNA beschermen, een praktisch gebruik van RNAi voor insecten bestrijding van plagen in de toekomst.
Introduction
RNAi is aangetoond als een effectieve methode om vechtpartij genexpressie via een mechanisme van een post-transcriptional silencing pathway geactiveerd door dsRNA moleculen in vele eukaryoten1. De afgelopen tien jaar van studie, RNAi uitgegroeid tot een nuttig instrument om te bestuderen van de functies van genen van ontwikkeling tot gedrag door uitputting van de expressie van specifieke genen via injectie en/of voeding van dsRNA in verschillende taxa van insecten2,3. Wegens de specificiteit en de robuustheid van de afbrekende werking, wordt de toepassing van RNAi momenteel beschouwd als een mogelijke strategie voor pest control beheer4,5. Echter, de efficiëntie van RNAi varieert sterk tussen insecten soorten, afhankelijk van de verschillende genen worden gericht en de leveringsmethoden. Een groeiende hoeveelheid bewijs suggereert dat de instabiliteit van dsRNA, die is afgebroken door ribonucleasen, een cruciale factor in de beperkte effectiviteit van RNAi5,6 is. Bijvoorbeeld, is de lage RNAi gevoeligheid in de Manduca sexta uiteengezet door het feit dat de dsRNA gemengd met Hemolymfe snel aangetaste binnen 1 uur7was. Ook is de aanwezigheid van alkalische nucleasen in de middendarm, die efficiënt geconsumeerde dsRNA degraderen, sterk gecorreleerd met lage RNAi efficiëntie in verschillende insecten orders8,9,10.
De mondelinge levering van dsRNA is bijzonder interessant voor de toepassing van RNAi in een strategie voor het toegangsbeheer van pest, maar een methode om de afbraak van dsRNA door de nucleasen in de middendarm retard heeft nog niet zijn ontwikkeld, die zou hebben het potentieel om effectieve RNAi via voeding. Echter, de apathie van RNAi mondelinge levering van dsRNA is gemeld door de grote hoeveelheid dsRNA, bijvoorbeeld 50 µg in Bombyx mori, voeding of continu voeding voor 8 dagen (in totaal 8 µg dsRNA) bij de locust-soorten. De Duitse kakkerlak, Blattella germinica, is zeer gevoelig voor RNAi door de injectie van dsRNA11,12,13,14, maar is niet ontvankelijk voor dsRNA via voeding. Onlangs, Lin et al. (2017) hebben aangetoond dat de dsRNA ingekapseld met liposoom luchtvaartmaatschappijen resulteert in succesvolle RNAi aan knockdown de α-tubuline genexpressie in de middendarm en trigger aanzienlijke sterfte van de Duitse kakkerlak15. Zoals de afbraak van dsRNA in de middendarm de beperkende factor voor mondelinge RNAi is, dienen de liposomen vervoerders als een voertuig te dsRNA behoeden voor degradatie, dat gemakkelijk toepassing op andere insecten met sterke nuclease activiteiten in de darm is. Van de nota, de reden voor de keuze van de specifieke transfectiereagens (Zie Tabel van materialen) gebruikten we zoals liposoom vervoerder in het huidige protocol is dat het voor insect cel lijn transfectie is getest met minder toxiciteit, volgens de instructies van de fabrikant. Volgens de vergelijking van verschillende liposoom transfectie systemen in Gharavi et al. (2013) 16, de efficiëntie van transfecting Klein Mengend RNA (siRNA) is ongeveer hetzelfde tussen dit en andere commercieel beschikbare systemen die zijn gebruikt voor dsRNA levering systemen in andere insecten17,18 . Bovendien is onze voeding methode voorzichtig genoeg om de juiste hoeveelheid dsRNA wordt ingenomen door elke kakkerlak, en dat de resultaten zijn robuust en bevestigd. Kortom aantonen het huidige protocol en de resultaten dat met behulp van dsRNA lipoplexes dsRNA stabiliteit verbetert en de deur naar het ontwerp van de mondelinge uitspraak van de strategie van RNAi opent, die is een veelbelovende aanpak voor de bestrijding van plagen in de toekomst.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol biedt een methode voor doeltreffend RNAi via mondelinge levering van dsRNA lipoplexes, waarbij bescherming tegen ribonuclease vertering in de middendarm sap van de Duitse kakkerlak. Zoals blijkt uit andere onderzoeken bij verschillende insecten diersoorten, is het slechte RNAi effect via mondelinge levering van dsRNA meestal verantwoord door de afbraak van dsRNA8,9,10. Dit protocol produceert liposomen die als besch…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Deze studie werd ondersteund door subsidies uit Taiwan (Ministerie van wetenschap en technologie, de meest 100-2923-B-002-002-MY3 en 106-2313-B-002-011-MY3 naar H.J.L.), Tsjechië (verlenen Agentschap van Zuid-Bohemen Universiteit, GAJU verlenen 065/2017/P Y.H.L), en Spanje ( Spaanse ministerie van economische zaken en concurrentievermogen, verleent CGL2012-36251 en CGL2015-64727-P X.B., en de Catalaanse regering, toekennen 2014 SGR 619 X.B.); het kreeg ook financiële steun uit het Europees Fonds voor de economische en regionaleontwikkeling (EFRO fondsen te X.B.).
Materials
| GenJe Plus DNA in vitro Transfection reagent | SignaGen | SL100499 | for lipoplexes preparation |
| Blend Taq plus | TOYOBO | BTQ-201 | for PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | ABI | 4385612 | for qPCR |
| FirstChoice RLM-RACE Kit | Invitrogen | AM1700 | for 3' UTR identification |
| MEGAscript T7 Transcription Kit | Invitrogen | AMB13345 | for dsRNA synthesis |
| TURBO DNase | Invitrogen | AM2239 | remove DNA template from dsRNA |
| TRIzol | Invitrogen | 15596018 | for dsRNA or total RNA extraction |
| RQ1 RNase-Free Dnase | Promega | M6101 | remove DNA template from total RNA |
| chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 | for dsRNA or total RNA extraction |
| 2-Propanol | Sigma-Aldrich | I9516 | for dsRNA or total RNA extraction |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 24102 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Diethyl pyrocarbonate, DEPC | Sigma-Aldrich | D5758 | for RNase free water preparation |
| glucose solution | Sigma-Aldrich | G3285 | for lipoplexes preparation |
| Sodium chloride, NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | insect saline buffer formula |
| Potassium chloride, KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | insect saline buffer formula |
| Calcium chloride, CaCl2 | Sigma-Aldrich | C1016 | insect saline buffer formula |
| Magnesium chloride hexahydrate, MgCl2.6H2O | Sigma-Aldrich | M2670 | insect saline buffer formula |
| EGTA | Sigma-Aldrich | E3889 | enzyme inhibitor |
| dissecting scissor | F.S.T. | cockroach dissection | |
| fine tweezers | F.S.T. | cockroach dissection | |
| flexible tweezer | F.S.T. | cockroach holding | |
| pipetman | RAININ | P10 | sample preparation |
| microcentrifuge tube | Axygen | MCT175C, PCR02C | sample preparation |
| pipette tip | Axygen | sample preparation | |
| vortexter | Digisystem | vm1000 | sample preparation |
| Minispin centrifuge | The Gruffin Group | GMC 206 | for liquid spin down |
| Centrifuge | ALC | PK121R | sample preparation |
| pH meter | JENCO | 6071 | for pH adjust |
| micro-volume spectrophotometer | Quawell | Q3000 | nucleic acid quantitative |
| PCR Thermal cycler | ABI | 2720 | for template PCR or dsRNA synthesis incubation |
| quantitative real-time PCR | ABI | StepOne plus | gene expression quantitative |
| Centrifugal Vacuum Concentrators | eppendorf | 5301 | for dsRNA or total RNA extraction |
| Multipette | eppendorf | xstream | for real-time PCR sample loading |
| Agarose I | amresco | 0710 | for nucleic acid electrophoresis |
| tub gene specfifc forward preimer | tri-I biotech | GGG ACA AGC CGG AGT GCA GA | |
| tub gene specfifc reverse preimer | tri-I biotech | TCC TGC TCC TGT CTC GCT GA | |
| dsTub template forward primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA CAA GCC GGA GTG CAG | |
| dsTub template reverse primer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT CCT GCT CCT GTC TCG CTG | |
| dsEGFP template forward preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT ATG GTG AGC AAG GGC GAG GAG | |
| dsEGFP template reverse preimer | tri-I biotech | TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGT GGC GGA TCT TGA AGT TCA CC | |
| tub qPCR forward primer | tri-I biotech | GGA CCG CAT CAG GAA ACT GGC | |
| tub qPCR reverse preimer | tri-I biotech | CCA CAG ACA GCC TCT CCA TGA GC | |
| ef1 qPCR forward primer | tri-I biotech | CGC TTG AGG AAA TCA AGA AGG A | |
| ef1 qPCRreverse preimer | tri-I biotech | CCT GCA GAG GAA GAC GAA G |
References
- Hammond, S. M. Dicing and slicing: The core machinery of the RNA interference pathway. FEBS Lett. 579, 5822-5829 (2005).
- Bellés, X. Beyond drosophila: RNAi in vivo and functional genomics in insects. Annu. Rev. Entomol. 55, 111-128 (2010).
- Wynant, N., Santos, D., Vanden Broeck, J., Jeon, K. W. Chapter Five – Biological Mechanisms Determining the Success of RNA Interference in Insects. International Review of Cell and Molecular Biology. 312, 139-167 (2014).
- San Miguel, K., Scott, J. G. The next generation of insecticides: dsRNA is stable as a foliar-applied insecticide. Pest Manag. Sci. 72, 801-809 (2016).
- Scott, J. G., et al. Towards the elements of successful insect RNAi. J. Insect Physiol. 59, 1212-1221 (2013).
- Joga, M. R., Zotti, M. J., Smagghe, G., Christiaens, O. RNAi efficiency, systemic properties, and novel delivery methods for pest insect control: What we know so far. Front. Physiol. 7, (2016).
- Garbutt, J. S., Bellés, X., Richards, E. H., Reynolds, S. E. Persistence of double-stranded RNA in insect hemolymph as a potential determiner of RNA interference success: Evidence from Manduca sexta and Blattella germanica. J. Insect Physiol. 59, 171-178 (2013).
- Arimatsu, Y., Kotani, E., Sugimura, Y., Furusawa, T. Molecular characterization of a cDNA encoding extracellular dsRNase and its expression in the silkworm, Bombyx mori. Insect Biochem. Mol. Biol. 37, 176-183 (2007).
- Wang, K., et al. Variation in RNAi efficacy among insect species is attributable to dsRNA degradation in vivo. Insect Biochem. Mol. Biol. 77, 1-9 (2016).
- Wynant, N., et al. Identification, functional characterization and phylogenetic analysis of double stranded RNA degrading enzymes present in the gut of the desert locust, Schistocerca gregaria. Insect Biochem. Mol. Biol. 46, 1-8 (2014).
- Huang, J. -. H., Belles, X., Lee, H. -. J. Functional characterization of hypertrehalosemic hormone receptor in relation to hemolymph trehalose and to oxidative stress in the cockroach Blattella germanica. Exp. Endocrinol. 2, 114 (2012).
- Lin, Y. -. H., Lee, C. -. M., Huang, J. -. H., Lee, H. -. J. Circadian regulation of permethrin susceptibility by glutathione S-transferase (BgGSTD1) in the German cockroach (Blattella germanica). J. Insect Physiol. 65, 45-50 (2014).
- Lozano, J., Kayukawa, T., Shinoda, T., Belles, X. A role for taiman in insect metamorphosis. PLOS Genet. 10, 1004769 (2014).
- Lozano, J., Montañez, R., Belles, X. MiR-2 family regulates insect metamorphosis by controlling the juvenile hormone signaling pathway. Proc. Natl. Acad. Sci. 112, 3740-3745 (2015).
- Lin, Y. -. H., Huang, J. -. H., Liu, Y., Belles, X., Lee, H. -. J. Oral delivery of dsRNA lipoplexes to German cockroach protects dsRNA from degradation and induces RNAi response. Pest Manag. Sci. 73, 960-966 (2017).
- Gharavi, J., et al. Chiral cationic polyamines for chiral microcapsules and siRNA delivery. Bioorg. Med. Chem. Lett. 23, 5919-5922 (2013).
- Whyard, S., Singh, A. D., Wong, S. Ingested double-stranded RNAs can act as species-specific insecticides. Insect Biochem. Mol. Biol. 39, 824-832 (2009).
- Luo, Y., et al. Differential responses of migratory locusts to systemic RNA interference via double-stranded RNA injection and feeding. Insect Mol. Biol. 22, 574-583 (2013).
- Liu, J., Smagghe, G., Swevers, L. Transcriptional response of BmToll9-1 and RNAi machinery genes to exogenous dsRNA in the midgut of Bombyx mori. J. Insect Physiol. 59, 646-654 (2013).
- Airs, P. M., Bartholomay, L. C. RNA interference for mosquito and mosquito-borne disease control. Insects. 8, 4 (2017).
- Taning, C. N. T., et al. Oral RNAi to control Drosophila suzukii: Laboratory testing against larval and adult stages. J. Pest Sci. 89, 803-814 (2016).
- Wu, S. Y., McMillan, N. A. J. Lipidic systems for in vivo siRNA delivery. AAPS J. 11, 639-652 (2009).
- Tam, Y. Y. C., Chen, S., Cullis, P. R. Advances in lipid nanoparticles for siRNA delivery. Pharmaceutics. 5, 498-507 (2013).
- Xia, Y., Tian, J., Chen, X. Effect of surface properties on liposomal siRNA delivery. Biomaterials. 79, 56-68 (2016).
