लेजर द्वारा फेफड़े के क्षय रोग घावों में दवाओं के स्थानिक ठहराव Microdissection तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (LCM-LC/
Summary
यहां, हम एक लेजर कब्जा microdissection नियंत्रण रेखा/एमएस विश्लेषण के साथ मिलकर स्थानिकी-फुफ्फुसीय तपेदिक granulomas के भीतर दवा वितरण यों का उपयोग कर प्रोटोकॉल का वर्णन । दृष्टिकोण उच्च स्थानिक विस्तार पर ऊतकों के भीतर दवा सांद्रता बढ़ाता है के लिए व्यापक प्रयोज्यता है ।
Abstract
तपेदिक अभी भी दुनिया भर में रुग्णता और मृत्यु का एक प्रमुख कारण है । मौजूदा औषध आहारों में सुधार और उपंयास चिकित्सीय विकास के लिए तत्काल आवश्यक हैं । खुराक टीबी दवाओं की क्षमता तक पहुँचने और खराब-संवहनी गल क्षेत्रों (caseum) फुफ्फुसीय granulomas के भीतर बैक्टीरिया को निष्फल करने के लिए सफल चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए महत्वपूर्ण है । प्रभावी चिकित्सकीय परहेजों इसलिए अनुकूल caseum प्रवेश संपत्तियों के साथ ड्रग्स शामिल होना चाहिए । वर्तमान नियंत्रण रेखा/एमएस विधि जैविक ऊतकों में दवा के स्तर को बढ़ाता है के लिए स्थानिक संकल्प क्षमताओं सीमित है, यह मुश्किल सही ऐसे भीतर पाया उन के रूप में छोटे ऊतक डिब्बों के भीतर निरपेक्ष दवा सांद्रता निर्धारित करने के लिए बना गल granulomas । यहां हम एक लेजर के संयोजन प्रोटोकॉल वर्तमान microdissection (LCM) रोग-नियंत्रण रेखा के साथ विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों/ इस तकनीक ग्रेन्युलोमा caseum के भीतर दवाओं की निरपेक्ष ठहराव प्रदान करता है, सेलुलर घाव और फेफड़े के ऊतकों को शामिल आसपास और, इसलिए, सही है कि जीवाणुनाशक सांद्रता प्राप्त किया जा रहा है निर्धारित करता है । क्षय रोग अनुसंधान के अलावा, इस तकनीक में रोगग्रस्त ऊतकों में दवाओं के स्थानिक हल ठहराव के लिए कई संभावित आवेदन हैं ।
Introduction
विशेष रूप से समाधान और दवा के स्तर को बढ़ाता है की क्षमता का निर्धारण करने के लिए एक महत्वपूर्ण आवश्यकता है कि क्या एंटी-तपेदिक दवाओं फेफड़े के घावों के भीतर सांद्रता1बंध्याकरण पर बैक्टीरियल आबादी तक पहुंचने । विशेष महत्व के घाव (caseum कहा जाता है) है, जो आम तौर पर बेसिली की सबसे अधिक संख्या में शामिल है और खराब vascularization के अभाव के कारण दवाओं के लिए सुलभ हो सकता है की गल कोर में दवा पैठ का निर्धारण है ।
घाव के प्रवेश का आकलन करने के लिए पारंपरिक तरीके, जो विलायक निष्कर्षण और तरल क्रोमैटोग्राफी मास स्पेक्ट्रोमेट्री (नियंत्रण रेखा/एमएस) विश्लेषण के बाद उत्पाद के फेफड़े के घावों की homogenization शामिल है, अत्यधिक संवेदनशील है और की दवाओं के लिए चयनात्मक ब्याज. हालांकि, इन तरीकों गरीब स्थानिक जानकारी प्रदान करते हैं, मूल homogenized ऊतक के आकार तक ही सीमित है । मास स्पेक्ट्रोमेट्री-आधारित इमेजिंग दृष्टिकोण, जैसे मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर desorption ionization (मालदी)2,3, desorption electrospray ionization (देसी)4 या तरल-बढ़ाया सतह निष्कर्षण5, 6 उच्च स्थानिकी हल इमेजिंग क्षमताओं का प्रस्ताव है, लेकिन प्रत्यक्ष ठहराव अत्यंत चुनौतीपूर्ण या विषम आयन दमन प्रभाव के कारण असंभव हो सकता है और विभिन्न सेल से analyte के निष्कर्षण क्षमता अलग या ऊतक के प्रकार7। इसके अतिरिक्त, सबसे सीधे ऊतक एमएस इमेजिंग दृष्टिकोण स्वाभाविक रूप से कम संवेदनशील है नियंत्रण रेखा/अंतर्जात प्रजातियों के क्रोमेटोग्राफिक जुदाई की कमी के कारण ionization और ऊतक से दवा के निचले विलायक निष्कर्षण दक्षता के लिए प्रतिस्पर्धा ।
लेजर कैप्चर microdissection (LCM) नियंत्रण रेखा/एमएस विश्लेषण के साथ संयुक्त नियमित रूप से अलग करने के लिए लागू किया गया है और proteomic अध्ययन के लिए विशिष्ट ऊतक क्षेत्रों की विशेषता8,9 और हाल ही में दवा ठहराव के लिए खुराक में उपयोग पशु ऊतक10। यहां हम एक अनुकूलित LCM नियंत्रण रेखा/एमएस (LCM-lc/एमएस) विश्लेषण के साथ विशिष्ट ग्रेन्युलोमा डिब्बों के भीतर विरोधी टीबी दवाओं यों तो लागू प्रोटोकॉल वर्तमान । लेजर कैप्चर microdissection प्रक्रिया में, एक यूवी लेजर पर माइक्रोस्कोप उद्देश्य के माध्यम से केंद्रित है ऊतक अनुभाग, जो कटौती और एक उपयोगकर्ता द्वारा परिभाषित पथ का पालन करके वांछित ऊतक क्षेत्र को अलग । गुरुत्वाकर्षण के लिए सहायता LCM (इस अनुसंधान के लिए इस्तेमाल तकनीक), ऊतक अनुभाग एक पतली बहुलक झिल्ली स्लाइड पर मुहिम शुरू की है (पालतू या कलम) और ऊतक एक संग्रह ट्यूब स्लाइड के नीचे साइट टोपी में कब्जा कर लिया है । दवाओं के उत्पादीय ऊतक और मानक नियंत्रण रेखा/MS दृष्टिकोण का उपयोग कर quantified से निकाले जाते हैं । ऊतक की मात्रा को एकत्र किया जाना आवश्यक अंततः ऊतक में मौजूद दवा की उम्मीद एकाग्रता से निर्धारित होता है और नियंत्रण रेखा की संवेदनशीलता/ दवाओं के अधिकांश विश्लेषण के लिए चिकित्सकीय स्तर पर खुराक और एक नियमित ट्रिपल quadrupole मास स्पेक्ट्रोमीटर का उपयोग कर विश्लेषण, ३,०००,००० µm2 (3 मिमी2) ऊतक सतह क्षेत्र के पर्याप्त है ।
इस प्रोटोकॉल स्थानिक रूपरेखा और पूर्ण LCM द्वारा की पेशकश की ठहराव के शक्तिशाली संयोजन-नियंत्रण रेखा/MS, टीबी granulomas के सभी डिब्बों के भीतर निरपेक्ष दवा सांद्रता प्रदान करने का वर्णन । तकनीक भी कई अलग रोगग्रस्त ऊतकों में दवा सांद्रता निर्धारित करने के लिए लागू किया जा सकता है महत्वपूर्ण दवा खोज और विकास की जानकारी प्रदान ।
Protocol
Representative Results
Discussion
फेफड़े के टीबी के घावों के भीतर दवाओं की स्थानिकी हल ठहराव कि दवा जोखिम अलग घावों के डिब्बों के भीतर रहने वाले जीवाणु आबादी के लिए सांद्रता निष्फल तक पहुँच जाता है यह निर्धारित करने के लिए आवश्यक है । LCM-?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पॉल ओ, Marizel मीना और इसाबेला Freedman पशु प्रयोगों के लिए धंयवाद, Jacquie गोंजालेज और डेनिएल वेनर NIH से खरगोश के ऊतकों के गामा विकिरण के साथ मदद के लिए लेजर पर कब्जा NIAID और पांडुलिपि के लिए microdissection के लिए पहले विचार और सलाह । इस काम को बिल ऐंड मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन (OPP1174780) और NIH साझा इंस्ट्रूमेंटेशन ग्रांट 1S10OD018072 से फंडिंग का समर्थन मिला । हम Leica LMD ६५०० माइक्रोस्कोप के लिए पहुंच प्रदान करने और विशेषज्ञता और सलाह साझा करने के लिए eliseo द्वारा ए Eugenin धंयवाद । खरीद, और के चल रहे समर्थन, LMD ६५०० मानसिक स्वास्थ्य अनुदान, MH096625, राष्ट्रीय मस्तिष्क संबंधी विकार और स्ट्रोक, NS105584, PHRI वित्त पोषण संस्थान (ई. ए. ई.) और जीएसके योगदान के राष्ट्रीय संस्थान द्वारा वित्त पोषित किया गया (ई. ए. ई.) ।
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
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