Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll mit Laser Capture Microdissection gepaart mit LC/MS-Analyse, um räumlich-Droge-Verteilungen innerhalb von Lungentuberkulose Granulome zu quantifizieren. Dieser Ansatz hat breite Anwendbarkeit auf Droge-Konzentrationen in den Geweben an hohe räumliche Details zu quantifizieren.
Abstract
Tuberkulose ist nach wie vor eine der Hauptursachen für Morbidität und Mortalität weltweit. Verbesserungen an vorhandenen Drogen-Therapien und die Entwicklung neuer Therapeutika werden dringend gebraucht. Die Fähigkeit der dosierten TB-Medikamente zu erreichen und Sterilisieren Bakterien innerhalb schlecht durchblutet nekrotische Regionen (Caseum) der pulmonale Granulome ist entscheidend für eine erfolgreiche therapeutische Intervention. Effektive therapeutische Therapien müssen daher Medikamente mit günstigen Caseum Eindringvermögen enthalten. Aktuelle LC/MS-Methoden zur Quantifizierung der Droge Ebenen in biologischen Geweben haben begrenzte räumliche Auflösung Fähigkeiten, macht es schwierig, genau festzustellen, absolute Droge Konzentrationen innerhalb kleiner Gewebe Fächer wie die gefunden in nekrotische Granulome. Hier präsentieren wir ein Protokoll mit LC/MS Quantifizierung Laser Capture Microdissection (LCM) pathologisch unterschiedliche Gewebe Regionen kombinieren. Diese Technik bietet absolute Quantifizierung von Medikamenten innerhalb von Granulomen Caseum, um zelluläre Läsion und unbeteiligte Lungengewebe und daher genau bestimmt, ob bakterizide Konzentrationen erreicht werden. Neben der Tuberkuloseforschung hat die Technik viele Anwendungsmöglichkeiten für räumlich aufgelöst Quantifizierung von Drogen im erkrankten Gewebe.
Introduction
Die Fähigkeit, räumlich zu lösen und zu quantifizieren Droge Ebenen ist eine wesentliche Voraussetzung für die Feststellung, ob Anti-Tuberkulose-Medikamente bakterielle Subpopulationen innerhalb pulmonale Läsionen bei Sterilisation Konzentrationen1erreichen. Von besonderer Bedeutung ist Medikament Eindringen in die nekrotischen Kern der Läsion (genannt Caseum), bestimmen, welche in der Regel enthält die höchste Anzahl von Bazillen und möglicherweise schlecht zugänglichen Drogen wegen fehlender Vaskularisierung.
Traditionelle Methoden zur Läsion eindringen, bewerten die Homogenisierung der ausgeschnittenen pulmonale Läsionen gefolgt von solvent-Extraktion und Analyse der Flüssigchromatographie-Massenspektrometrie (LC/MS) betreffen, sind sehr empfindlich und selektiv für die Medikamente der Interesse. Diese Methoden bieten jedoch schlechte räumliche Informationen, auf die Größe des ursprünglichen homogenisierte Gewebe beschränkt. Massenspektrometrie-basierte Bildgebung Ansätze, wie Matrix-assisted Laser Desorption ionisation (MALDI)2,3, desorption Electrospray Ionisierung (DESI)4 oder Flüssigkeit-Erweiterte Oberfläche Extraktion5, 6 bieten sehr räumlich aufgelöst imaging-Funktionen, direkte Quantifizierung kann jedoch extrem schwierig oder unmöglich aufgrund der heterogenen Ion Unterdrückung Effekte und unterschiedliche Extraktion Wirkungsgrade von Analyten aus der einzelnen Zelle oder Gewebe7. Darüber hinaus sind direkteste Gewebe MS bildgebenden Ansätze von Natur aus weniger empfindlich als LC/MS aufgrund fehlender chromatographische Trennung von endogenen Arten konkurrieren für Ionisierung und die geringeren Wirkungsgrad der solvent-Extraktion der Droge aus Gewebe.
Laser Capture Microdissection (LCM) in Kombination mit LC/MS-Analyse wurde routinemäßig angewendet zu isolieren und zu charakterisieren verschiedene Gewebe Regionen für Proteomik8,9 Studien und vor kurzem verwendet für die Droge Quantifizierung dosiert tierisches Gewebe10. Hier präsentieren wir Ihnen eine optimierte Protokoll Anwendung LCM kombiniert mit LC/MS (LCM-LC/MS)-Analyse, um Anti-TB-Medikamente in unterschiedlichen Granulom Fächer zu quantifizieren. Laser Capture Microdissection dabei konzentriert sich ein UV-Laser durch das Mikroskopobjektiv auf Gewebe, die schneidet und isoliert die gewünschte Gewebebereich ein Pfad durch den Benutzer definiert. Schwerkraft-unterstützte LCM (die Technik für diese Forschung verwendet), Abschnitt Gewebe wird auf einer dünnen Polymer-Membran-Folie (PET oder Stift) montiert und das Gewebe wird in einer Sammlung Rohr Kappe gelegen unterhalb der Folie erfasst. Die Medikamente werden aus dem ausgeschnittenen Gewebe extrahiert und quantifiziert mit LC/MS Standardansätze. Die Menge des Gewebes zu erhebenden erforderlich wird letztlich von der erwarteten Konzentration des Medikaments im Gewebe vorhanden und die Empfindlichkeit der LC/MS-Methode bestimmt. Für die meisten Analysen von Drogen auf therapeutische Ebenen dosiert und analysiert mit Hilfe einer routinemäßigen triple Quadrupol-Massenspektrometer, 3 Millionen µm2 (3 mm2) des Gewebes ist die Fläche ausreichend.
Dieses Protokoll beschreibt die kraftvolle Kombination von räumlichen Profilierung und vollständigen Quantifizierung von LCM-LC/MS, bietet absolute Droge Konzentrationen in allen Abteilen der TB Granulome angeboten. Die Technik kann auch angewendet werden, zu bestimmen, Droge-Konzentrationen in vielen verschiedenen erkrankten Geweben lebenswichtige Medikament Entdeckung und Entwicklung informieren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle Tierversuche erfolgten gemäß dem Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren der National Institutes of Health mit Genehmigung aus dem institutionellen Animal Care und Use Committee der NIAID (NIH), Bethesda, MD.
(1) Tierversuche und Gewebe-Sammlung
Dieser Abschnitt des Protokolls beschreibt Tier Verfahren und Probenentnahme Biosafety Level 3 (BSL3) Bedingungen. Ausführliche Protokolle der Mycobacterium Tuberculosis Aerosol Infektion Verfahren and Drug Administration, die Protokolle bei Kaninchen wurden beschriebenen zuvor11,12.
- New Zealand White Kaninchen (männlich und weiblich, ca. 4-5 Monate alt) mit M. Tuberculosis HN878 infizieren mit einem nur-Nase-Aerosol-System, wie oben beschrieben11.
- Verwalten Sie die gewählten Medikamente (Ethambutol im hier vorgestellten Beispiel) über die bevorzugte Route und einschläfern Sie die Tiere auf 2, 6 und 24 h nach Verabreichung. Erstens zu betäuben die Kaninchen durch intramuskuläre Injektion von Ketamin bei 35 mg/kg und Xylazin bei 5 mg/kg. Für zehn Minuten warten Sie, und bestätigen Sie richtige Anesthetization durch Kneifen die Rute und das Auge berühren. Wenn es keine Reaktion, einschläfern Sie durch intravenöse Gabe von Pentobarbital und Phenytoin (siehe Tabelle of Materials) in 1 mL/4,5 kg in 2 mL steriler Kochsalzlösung.
Hinweis: Diese Zeitpunkte sind optimal um das pharmakokinetische Profil Ethambutol abzudecken und Anpassung/Optimierung für andere Studie Medikamente erfordern. - Mit Pinzette, Schere und/oder Skalpell, entfernen Sie die Lungen aus der Brusthöhle, resezieren Sie Lunge Biopsien mit großen nekrotische Granulome in umliegenden unbeteiligte Lungengewebe (wie zuvor beschrieben3) eingebettet. Nekrotische Granulome erscheinen in Beige Farbe und in der Regel ragen leicht aus der umliegenden rot/Rosé-farbene Lunge. Um einfache Kryoschneiden zu erleichtern, damit Biopsien sind nicht größer als 2 x 1,5 x 1,5 cm.
- Mit Pinzette, Ort der Biopsie auf ein bereits beschriftete Cryomold Tablett mit den gewünschten Schnittfläche in direktem Kontakt mit der Basis des Fachs. Nach dem Einfrieren, wird dies eine flache Oberfläche bieten, aus der Cryosections geschnitten werden.
- Fixieren Sie die Biopsie in flüssigem Stickstoff Dampf. Füllen Sie einen Styropor-Behälter bis zu einer Tiefe von 2 Zoll mit flüssigem Stickstoff und einem Metalldraht Rohr Gestell. Das Rack sollte ragen über der Oberfläche des flüssigen Stickstoffes, die Bereitstellung einer flachen Oberfläche, auf der die Gewebe-Trays platziert werden. Setzen Sie den Deckel wieder auf die Styropor-Behälter und lassen Sie Gewebe für 10 Minuten vollständig einfrieren.
- Entfernen Sie die Gewebe-Fächer, wickeln Sie schnell in Aluminiumfolie ein und in individuell beschriftet, wiederverschließbaren Plastiktüten und Dichtung. Übertragen Sie auf-80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung.
Hinweis: Schritte 1.1-1.6 sind in BSL3-Bedingungen (einschließlich alle tierische Arbeit und Umgang mit infizierten Organen und Geweben) durchgeführt. Gamma bestrahlen die Lunge Biopsien bei 3 Megarads Handhabung außerhalb BSL3 Containment zu ermöglichen. Laser Capture Microdissection auf sterilisierte Gewebe kann durchgeführt werden, innerhalb der BLS3 Anlage wenn Sicherheitsprotokolle zugelassen sind vorhanden. Allerdings beschreibt der Rest dieses Protokolls Weiterverarbeitung in einem BSL-2-Anlage.
(2) Gewebe schneiden
- Die gewünschte Arbeitstemperatur des Kryostaten gesetzt. Die Gamma-Bestrahlung Lungenbiopsie von-80 ° C Lagerung auf den Kryostaten übertragen und für 30 Minuten bis die Gewebetemperatur equilibrate lassen. Hinweis:-20 bis-22 ° C ist optimal für TB Läsion Biopsien.
- Mit einer Pinzette, beheben Sie die Biopsie an der Kryostat-Futter mit einem kleinen Betrag der optimale Temperatur Klebstoff (OCT) auf um die Basis des Gewebes an das Futter zu halten. Das Gewebe zu orientieren, so dass die flache Oberfläche (das war in Kontakt mit der Basis der Cryomold) die freiliegende Oberfläche zum Schneiden ist. Gewährleisten Sie, dass das Office-Anpassungstool die Gewebeoberfläche nicht verschmutzt, da dies die anschließende Massenspektrometrie Analyse beeinträchtigen.
- Schneiden Sie drei Gewebeschnitte bei 25 µm Dicke und montieren Sie auf PET-Membran-Folien. Sanft berühren Sie die Membran zum Abschnitt Gewebe und entfernen. Wenn zu viel Druck ausgeübt wird, kann die dünne Membran reißen.
- Vermeiden Sie übermäßige Handhabung der Dias vor der Montage, da dies in der PET-Membran immer aufgeladen und schlechte Adhäsion von der Gewebeschnitte zur Folge. Sicherstellen Sie, dass die Membran Folie ist bei Raumtemperatur Tauwetter-Montage und erfolgreiche Verklebung des Gewebes an der Membran zu ermöglichen.
- Entfernen Sie die Folie aus der Kryostat und 3 Minuten an der Luft trocknen lassen. LCM-LC/MS/MS nicht sofort durchgeführt werden, verschließen Sie die Folie in einem luftdicht verschließbaren Beutel und Transfer zum-80 ° C Lagerung bis zur Präparation erforderlich.
- Schneiden Sie einen angrenzenden Abschnitt 10-12 µm und Tauwetter-Mount auf einem standard Objektträger für Hämatoxylin und Eosin (H & E) Färbung und Referenz. Weitere Querschnitte können in dieser Zeit für andere gewünschte Histochemie Flecken (z. B. Ziehl-Niellsen zur Visualisierung von Mycobacterium Tuberculosis (MTB)).
(3) Mikrodissektion
- Versiegelten Beutel mit der Folie von-80 ° C Lagerung und um Raumtemperatur für 5 Minuten zu erreichen.
Hinweis: Wenn die kalte Folie sofort die Labor-Atmosphäre ausgesetzt ist, wird das Gewebe mit Kondensation beschichtet werden, und die räumliche Integrität des Arzneimittels beeinträchtigt werden. - Schalten Sie das Mikroskop und Laser (Laser benötigt ca. 5-10 Minuten warm up, bevor schneiden begonnen werden kann). Flat-Cap 0,20 mL PCR-Röhrchen in den Halter zu laden.
- Objektträger aus dem Beutel nehmen und nehmen ein optisches Bild des Abschnitts Gewebe auf der PET-Folie mit einem Flachbettscanner.
- Legen Sie die Folie in den Diahalter (Gewebeseite nach unten) und bestimmte Granulom Regionen von Interesse, die mit dem Mikroskop Software weisen Sie separate primärgefäßen zu. In der Regel werden diese "unbeteiligte Lunge", "zelluläre Granulom," und "Caseum" (nekrotische Mitte), kann aber variieren je nach der spezifischen Pathologie der Granulom/Biopsie.
- Konzentrieren Sie sich auf das Gewebe mit den 5 X Mikroskopobjektiv. Diese Vergrößerung sollte einen guten Überblick über das Gewebe mit beiden zellulären und nekrotischen Granulom Bereichen bieten. Wählen Sie in der Software das Rohr bezeichnet "Caseum" in Position unter dem Gewebe verschieben.
- Geben Sie die gewünschte Dissektion-Parameter. Typische Einstellungen für eine 25 µm dicken Lunge Abschnitt sind Laserleistung 30, 15, und Blende 35 (willkürliche Einheiten). Jedoch werden diese unterscheiden sich je nach Mikroskop verwendet und Potenzial rückläufiger macht aufgrund des Alters des Lasers.
- Wählen Sie das Werkzeug "frei-ziehen" und mit Maus oder Touchscreen Stift, umreißen Sie die gewünschte Region für Dissektion. Die Fläche der Region werden in der Software angezeigt. Halten Sie die ausgewählte Regionen unter 500.000 µm2 (0,5 mm2) einfacher Dissektion zu erleichtern. Wiederholen Sie die Dissektion bis 3 Millionen µm2 (3 mm2) insgesamt in der Röhre Kappe gesammelt worden.
- Gelegentlich kann die zergliederten Region bleiben stecken an die umgebenden Membran (z.B. durch statische Anziehung) und fallen nicht in die Sammlung-Kappe. Entfernen Sie diese Regionen aus die kumulierte Fläche insgesamt durch Auswahl und innerhalb der Software manuell zu entfernen.
- Wählen Sie die Kappe für "zelluläre Läsion" und sammle 3 Millionen µm2 des Gewebes, die nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.7 beschrieben.
- Wählen Sie die Kappe für "unbeteiligte Lunge" und sammle 3 Millionen µm2 des Gewebes, die nach dem gleichen Verfahren wie in Schritt 3.7 beschrieben. Beachten Sie, dass unbeteiligte Lungengewebe vielen Bronchiolen und alveoläre Räume enthält. Achten Sie besonders auf diese von den definierten Gewebe Regionen für Dissektion auszuschließen.
- Entfernen Sie den Deckel sorgfältig ausclipsen Sie, verschließen Sie und beschriften Sie jedes Rohr. Schützen Sie die seziert Gewebe aus den umliegenden Luft Störungen (z. B. Air Flow Störungen durch eine sich öffnende Tür). Analysieren die seziert Gewebe sofort, oder bei-80 ° C aufbewahren und Auftauen vor der Verarbeitung und Analyse der LCMS.
(4) Extraktion und Analyse der LCMS
- Bereiten Sie Extraktionslösung von 1:1 Acetonitril/Methanol mit Ethambutol d-10 interne Standard vor. Bei der Auswahl eines internen Standards verwenden eine stabile bezeichnete Form des Analyten Medikaments mit ausreichend Masse Verschiebung Isotop zu vermeiden (z. B. Deuterium-mit der Bezeichnung EMB in dieser Demo verwendet) cross sprechen zwischen den Analyten Droge und Standard (in der Regel mindestens 4 Daltons) .
Hinweis: Schaffung von Standards im Homogenat von jedem jeweiligen Gewebetyp ist schwierig, denn es gibt nur eine sehr begrenzte kontrollgewebe mit dem Homogenat Normen erstellt werden soll. Als Alternative zu Standards von einer stacheligen Homogenat Probe zu machen kann ein Standard erstellt werden, indem leere Gewebe und Testverbindung zusammen und extrahieren. Ein Volumen von kontrollgewebe in eine homogenisierte, die das Ziel-Volume von der Studie Probe Gewebeschnitte entspricht wird direkt mit einer Menge an die Testverbindung kombiniert, die in einer bestimmten Konzentration vorhanden sein würde. - Berechnen Sie das Zielgewebe Volumen anhand der Fläche und Dicke des Abschnitts Gewebe und bestimmen Sie den erforderlichen Verdünnungsfaktor für das Homogenat über das Volumen der Homogenat, die von der Norm und QC Proben hinzugefügt werden. Berechnungen sind unten für 3 Millionen µm2 (3 mm2) seziert Zielgebiet mit 25 µm Dicke und 2 µL Volumen von Homogenat dargestellt.
- Unter der Annahme einer Gewebe-Dichte von 1 g/mL, Homogenat Lager vorbereiten, indem mit einem Gewicht von 50 mg kontrollgewebe und Hinzufügen von PBS-Puffer zu verdünnen (mit Hilfe den 26.67 Homogenat Verdünnungsfaktor errechnet im Schritt 4.2, das Verdünnungsmittel 1,283 mL). Homogenisieren von Perle gegen Lungengewebe und PBS-Puffer für 5 Minuten bei 1750 u/min auf einem Wulst-Homogenisator.
- Verdünnen Sie 1 mg/mL Wirkstoffkonzentration Bestände im 1:1 Acetonitril/Wasser Standardkurve Spick Lösungen zu erstellen. Spick standard Konzentrationen auf der Grundlage der Spike-Volumen und das Zielvolume Gewebe zu bestimmen. Dargestellte Beispiel ist für eine 100 ng/mL standard mit einer 10 µL Spike Volumen.
- Entfernen Sie die Röhrchen mit Microdissected Gewebe von-80 ° C Lagerung und erlauben Sie, um Raumtemperatur für 5 Minuten zu erreichen.
- Die Röhrchen mit Microdissected Gewebe fügen Sie 10 µL 1:1 Acetonitril/Wasser-Lösung und 2 µL PBS-Puffer hinzu.
- Fügen Sie für Standardkurve und Qualitätskontrolle Röhren 10 µL Lösung 2 µL Kontrolle Lunge Homogenat Spick.
- Jedes Rohr 50 µL der Extraktionslösung hinzufügen.
- Vortex jede Röhre für 5 Minuten, 5 Minuten lang beschallen und Zentrifugieren bei 5000 u/min für 5 Minuten einen Pellet Film- und Gewebe in jedem Röhrchen zu bilden.
- 50 µL überstand auf eine 96-Well Deep-Well-Platte übertragen und mit einer zusätzlichen 50 µL deionisiertes Wasser in jede Vertiefung verdünnen.
- Durchführen Sie LC/MS/MS-Analyse mit optimierten Geräteparameter für Ethambutol und Ethambutol-d10 interner Standard (wie oben beschrieben im Detail12).
- Verwenden Sie ein Verdünnungsfaktor, um für die genaue Menge des Gewebes seziert für jede Probe zu korrigieren.
5. die Methodenvalidierung
- Erstellen Sie eine Homogenat im Lungengewebe Kontrolle durch die Kombination von 1 Teil Lunge, 2 Teile PBS und 3-4 stahlkügelchen. Schlagen Sie Lungengewebe und PBS-Puffer für 5 Minuten bei 1750 u/min mit einer Wulst-Homogenisator.
- Spike der Homogenat durch Zugabe von 10 µL von 1 mg/mL Ethambutol DMSO Lager in 990 µL Homogenat erstelle ich eine Endkonzentration von 10.000 ng/mL (10 mg/mL) und Vortex für 1 Minute.
- Erstellen Sie einen gefrorenen Homogenat Block durch das Homogenat in eine Cryomold Gießen und schnell Einfrieren auf Trockeneis für 5 Minuten.
- Bereiten Sie 25 µm Dicke Abschnitte aus dem Homogenat Block wie in 2.1-2.5 beschrieben vor.
- Das Zielgebiet Gewebe wie angegeben in Schritten 3.2-3.10 zu sezieren.
- Die Röhrchen mit Microdissected Gewebe fügen Sie 10 µL 1:1 Acetonitril/Wasser und 2 µL PBS-Puffer hinzu.
- Jedes Rohr 50 µL der Extraktionslösung hinzufügen. Schritte zum Erstellen einer Standardkurve und bestimmen die Wirkstoffkonzentration im Gewebe Homogenat Block 4,9-4.12.
- Berechnen Sie Extraktionseffizienz mit Hilfe der folgenden Formel:
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ein Überblick über die LCM-LC/MS-Ansatz ist in Abbildung 1dargestellt. Nach der Sterilisierung des Gewebes durch Gamma-Bestrahlung, statt alle weiteren Schritte (von Gewebe schneiden ab) außerhalb BSL3-Bedingungen. Abbildung 2 zeigt die Läsion Biopsie Abschnitte vor und nach dem Gewebe isoliert von LCM. Nekrotische und zelluläre Bereiche des TB Läsionen können leicht identifiziert und isoliert durch visuelle Inspektion der optischen Bildern allein (ohne die Anforderung bezieht sich auf benachbartes Gewebe histologisch-gefärbten Abschnitte). Die Dissektion Prozess entsteht einen sauberen Schnitt mit minimaler Störung des umliegenden Gewebes, und 3 Millionen sezieren µm2 (3 mm2) der jeweiligen Region des Interesses von Läsionen dauert ca. 1 Stunde insgesamt.
Die Extraktionseffizienz und Stabilität der LCM-LC/MS-Methode wurde anhand Ethambutol EMB-dotierten Lunge Homogenat (Tabelle 1). Vollständige Extraktion der Droge wurde beobachtet, und keine Droge Stabilitätsprobleme wurden durch die Dissektion und Extraktion Prozess erkannt. Das LCM-LC/MS-Extraktion und Quantifizierung Protokoll validiert wurde weiter durch die im Vergleich zu etablierten LC/MS Quantifizierungsmethoden angewandt, um die gleichen Gewebe. Aufgrund der inhärenten Heterogenität der nekrotischen pulmonale TB Läsionen und die schlechte räumliche Spezifität von standard Gewebe Homogenisierung angeboten validiert wir die LCM-LC/MS-Methode durch direkten Vergleich Medikament Konzentrationen in unbeteiligte Lunge analysiert, indem beide analytische Techniken (aufgrund seiner relativ hohen Gewebe Homogenität). Tabelle 2 zeigt die Droge-Konzentrationen in unbeteiligte Lunge aus Biopsien entnommen drei Ethambutol dosiert Kaninchen wie bewertet: 1) 25 µm dicken Gewebeschnitte Homogenisieren und Analyse von standard LC/MS, und (2) LCM-LC/MS-Analyse der unbeteiligte Lunge Bereiche einer angrenzenden 25 µm dicken Gewebe Abschnitt entnommen. Die Daten zeigen, dass zwei Ansätze konsequente Quantifizierung Daten, demonstriert die Eignung für die routinemäßige räumliche Quantifizierung zu erzeugen.
Wir haben LCM-LC/MS Quantifizierung räumlich-viele bestehende und neue Anti-TB-Medikamente innerhalb pulmonale Läsionen angewandt. Abbildung 3A zeigt Beispieldaten von MTB-infizierten Kaninchen dosierten Fließgleichgewicht mit Ethambutol. LCM-LC/MS aktiviert volle Quantifizierung des Medikaments innerhalb Caseum, zelluläre Läsion und unbeteiligte Lunge Gewebe Bereiche aufgelöst. EMB wurde beobachtet, dringen auch in die Läsion zu sterilisierenden Konzentration innerhalb der nekrotische Caseum erreichen. Das entsprechende MALDI-MS-Bild des EMB Vertrieb erworben aus angrenzenden Gewebe zeigt Abbildung 3 b. Die qualitative MALDI-MS-Bilder korreliert gut mit der quantitativen LCM-LC/MS-Daten mit niedriger Droge-Konzentrationen in der nekrotische Caseum im Vergleich zu den zellulären Rim erkannt. LCM-LC/MS-Daten wurde durch direkten Vergleich zum Gewebe Homogenates von standard LC/MS analysiert validiert.
Abbildung 1 : Schematischer Ablauf LCM-LC/MS. Hase Lunge Biopsien mit nekrotischen Läsionen zusammen mit umliegenden unbeteiligte Lunge gesammelt und eingefroren. Cryosections sind auf dünnen PET Membranen geschnitten und unbeteiligte Lunge, zellulären und caseosa Läsion sind seziert und isoliert für die Quantifizierung von LC/MS. angepasst von Zimmerman Et al. 12 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2 : Läsion (A, B) und unbeteiligte Lunge (C, D) als sie erscheinen unter dem Mikroskop vor (A, C) und nach (B, D) Mikrodissektion. Caseosa Läsion Bereiche erscheinen dunkler und "geknackt" im optischen Bild Scan (A, grünen Umriss). Zelluläre Läsion ist in der Farbe heller und festere Struktur (A, rote Umrandung). Unbeteiligte Lunge sollte mindestens 5 mm entfernt von der Läsion Grenze abgetastet werden und erscheint rot/rosa in der Farbe (C, Cyan Gliederung). Skalieren von Bars (schwarz, blau und violett) = 400 µm. Beachten Sie, dass nur Flächen unbeteiligte Lunge ausgewählt werden sollen, um zu vermeiden, einschließlich der alveolären Räume und Bronchiolen in die gesamte Oberfläche des Gewebes erfasst (siehe d). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3 : Beispiel LCM-LC/MS-Dataset aus Läsion Biopsien entnommen zwei Kaninchen mit 100 mg/kg EMB für 7 Tage dosiert. (A) günstige Eindringen des Medikaments in allen Lungen- und Läsion Abteilen wurde beobachtet. Droge-Konzentrationen von LCM-LC/MS (hohlschienen) Studienfachs quantifiziert wurden in starke Zustimmung mit denen aus homogenisierten seziert Läsionen durch standard LC/MS quantifiziert (Solid bars, Mittelwert ± standard Abweichung, n = 3-8). Die minimale Konzentrationen erforderlich, 99 % der extrazellulären replizierende Bazillen (MBC-99) und 99 % der intrazellulären Bazillen in Makrophagen (iMBC99) zu töten sind angegeben. (B) Oberseite: MALDI-MS-Bild zeigt die Verteilung der EMB [M + H]+ Ion (m/Z 205.193) in ein benachbartes Gewebe-Abschnitt. Beachten Sie, dass die MALDI-MS-Bild schlechter Eindringen von EMB Caseum aufgrund der vorliegenden Droge-Konzentrationen unterhalb der unteren Grenze der Nachweisgrenze (LOD) der Technik wird suggeriert. Die räumliche Spezifität und überlegene LOD von LCM-LC/MS zeigen jedoch, dass das Medikament sterilisieren Konzentrationen innerhalb aller Läsion Fächer einschließlich der Caseum erreicht ist. Untere Leiste: Hämatoxylin und Eosin gefärbt Gewebe Abschnitt direkt zum Abschnitt für MALDI MSI verwendet. Cellular (C) und nekrotische Granulome (NG) wurden in das Gewebe. Der Caseum Kern ist in weiß dargestellt. Adaptiert von Zimmerman Et al. 12 Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Seziert Bereich (µm-2) | EMB Konz. (ng/g) gemessen (n = 3) | EMB-Verwertung (%) (n = 3) |
| 3 Millionen | 10633 (±404) | 106 (±4) |
| 5 Millionen | 10057 (±1132) | 101 (±11) |
| 10 Millionen | 10563 (±1128) | 105 (±11) |
Tabelle 1: Extraktionseffizienz der LC-LC/MS-Methode zur Quantifizierung der EMB in Lunge. Vollständige Wiederherstellung der EMB verzeichneten die EMB dotierten Homogenat seziert Lungengewebe für alle ausgewerteten Gewebe Volumes.
| Kaninchen-ID | LC/MS EMB (ng/g) | LCM-LC/MS EMB (ng/g) | Differenz (%) |
| 899 | 2910 | 3320 | 14 |
| 904 | 2010 | 1870 | -7 |
| 911 | 2150 | 2370 | 9 |
Tabelle 2: Vergleich des EMB Quantifizierung unbeteiligte Lunge Biopsien aus 3 dosierten Kaninchen mit LCM-LC/MS. und LC/MS Gleichwertige Medikament Konzentrationen nachgewiesen durch Methoden und kein Verlust des Signals durch Abbau oder Absaugung während der LCM-LC/MS-Prozess wurde beobachtet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Räumlich aufgelöst Quantifizierung von Medikamenten innerhalb pulmonale TB Läsionen ist erforderlich, um festzustellen, ob Arzneimittelexposition sterilisieren Konzentrationen an Bakterienpopulationen mit Wohnsitz innerhalb der verschiedenen Läsion Fächer erreicht. Die hier beschriebene LCM-LC/MS-Methode ermöglicht absolute Quantifizierung von Anti-TB-Medikamente in alle Fächer der Läsion, einschließlich der Bakterien-reiche Caseum, mit nur 1-3 Gewebeschnitte insgesamt. Traditionelle Gewebe Homogenisierung und LC/MS Ansätze zur Quantifizierung der Droge im Gewebe häufig fehlen die räumlichen Besonderheiten um spezifische Läsion Fächer zu beheben und selbst wenn es möglich ist, gibt es erhebliches Potenzial zur cross-Mobilfunk verunreinigen und nekrotische Läsion Bereiche während der manuelle Extraktion.
Die LCM-LC/MS-Ansatz hat mehrere Vorteile, Massenspektrometrie-basierte imaging-Technologien. Primär unter diesen sind die voll quantitativen Fähigkeiten der Methode und die zusätzliche Empfindlichkeit der LC/MS-Analyse aufgrund der Droge von störenden/unterdrücken endogene Arten über chromatographische Trennung zu lösen. MALDI-MSI bietet jedoch detailliertere räumliche Informationen zur Verteilung von Medikamenten. Da MALDI-MSI und LCM-LC/MS/MS die gleiche Probe Vorbereitungsschritte benötigen, gefrorene Gewebeschnitte zu generieren, können die beiden Techniken parallel auf der gleichen Gewebe Biopsie bietet volle Quantifizierung neben hoch-detaillierte Bildgebung des Medikaments durchgeführt werden Verteilung. Ein Beispiel für die Forderung nach höheren analytischen Sensitivität ist in Abbildung 3dargestellt. Nur wurden sehr niedrige Niveaus von EMB-Signal erkannt, in der zentralen nekrotischen Granulom Region der MALDI-MS-Bild (siehe Abb. 3 b), was darauf hindeutet, dass Caseum Durchdringung des Medikaments ist schlecht. Jedoch aufgrund der überlegenen Begrenzung der Erkennung von LCM-LC/MS wurde das Medikament deutlich zu sterilisierenden Konzentrationen in diesem Fach erreichen und die Wirkstoffkonzentration anwesend war überwiegend nicht nachweisbar durch MALDI (Abb. 3A).
Gewebe Färbung Protokolle werden in der Regel vor LCM für Proteomik-Anwendungen verwendet, damit einfache Identifizierung der Bereiche der Gewebe und befindet sich in Zell-Populationen. Routine histochemische Flecken wie z. B. H & E nicht mit Drogen Quantifizierung kompatibel sind, da viele Lösungsmittel Waschschritten beteiligt das Medikament aus dem Gewebe Abschnitt anderen würde. Angrenzenden Zuschnitte können mit H & E gefärbt und als Leitfaden für Mikrodissektion verwendet werden. Jedoch ist dies normalerweise nicht erforderlich, da die Läsion Abteile optisch unter dem standard LCM-Hellfeld-Mikroskop (Abbildung 2) gelöst werden können.
Optimierung der Schneiden und Mikrodissektion Schritte ist entscheidend für erfolgreiche Läsion Quantifizierung. Während der Entwicklung der Methode haben wir zwei unterschiedliche Membranmaterialien, Polyethylenterephthalat (PET) und Polyethylen naphthalate (PEN) als Substrat für die Montage der Gewebeschnitte für Mikrodissektion ausgewertet. PEN-Membranen litt erhöhte statische Aufladungen im Vergleich zu PET-Membranen und etwa 30 % aller sezierten Gewebe Bereiche wurden durch statische Anziehung zwischen der Membran und der zergliederten Gewebe Region verloren. Aus diesem Grund wurden PET Membranen für zukünftige Sezierungen durch die deutlich reduzierte statische Anziehungskraft beobachtet ausgewählt (nur 5 % der Regionen seziert aus PET Membranen bei der LCM verloren gingen).
Die Stabilität der Drogen in Gewebeschnitten ist ein wichtiger Aspekt bei der Gestaltung einer LCM-LC/MS-Studie. Beim Schneiden und Dissektion sind die Gewebeschnitte Lab Temperatur und Licht für einen Zeitraum von mindestens 1 Stunde ausgesetzt. Weitere Fragen zu berücksichtigen sind Extraktionseffizienz des Medikaments aus Gewebeschnitten, da gibt es keine Homogenisierung Schritt beteiligt (Extraktion erfolgt nur durch Vortex mischen und Beschallung). Nach unserer Erfahrung leiden die Extraktion nicht unter dem Mangel an Gewebe Homogenisierung durch das hohe Extraktion Lösungsmittel Gewebe-Verhältnis verwendet und die Schlankheit der Gewebeschnitte seziert. Unsere Beobachtungen sind im Rahmen einer zuvor beschriebenen Online-LCM-LC/MS Methode entwickelt, um Propranolol in Microdissected Gewebeschnitte von Gehirn und Leber, zu quantifizieren, wo vollständige Extraktion der Droge aus Gewebe von 20 µm und 40 µm dicken beobachtet wurde Sektionen10. Wir validiert die Effizienz der Extraktion der Droge und die Droge-Stabilität bei der LCM durch direkten Vergleich Lunge Gewebe Konzentrationen (aus dem gleichen Kaninchen und Lungenflügel) analysiert von LCM-LC/MS mit Konzentrationen von standard Gewebe bestimmt Homogenisierung und LC/MS (ein Beispiel ist in Tabelle 1dargestellt). Dieser Vergleich ermöglicht es uns, festzustellen, ob eine Änderung des Signals zwischen den beiden Methoden stattfindet.
Die Dichte der seziert Gewebe Regionen ist auch ein wichtiger Aspekt bei der Quantifizierung der Droge Ebenen basiert auf dem Gewebe Fläche oder Volumen. Dies ist von besonderer Bedeutung für die Lunge und Läsionen Biopsien, in denen die unbeteiligte Lunge Gewebe Bereiche einen insgesamt geringeren Dichte als Zell- und Caseum (weniger Gewebe haben, die die gleiche relative Fläche) durch die Anwesenheit von mehreren offenen Bronchiolen und alveoläre Räume. Die Auswirkungen dieser Unterschied in der Dichte können gemildert werden, indem man sorgfältig um die offenen Flächen zu vermeiden, auch sie in die kumulierte Fläche der gesammelten Gewebe (wie in Abbildung 2dargestellt).
Eine weitere Einschränkung ist, dass die vorgestellte LCM-LC/MS-Methode nur total Wirkstoffkonzentration im isolierten Gewebe (gemeinsam mit allen Gewebe Homogenisierung, solvent-Extraktion und LC/MS Quantifizierung Ansätze) quantifiziert und sich nicht löst proteingebundener Medikament Konzentrationen von ungebundenen Brüche. Mikrodialyse ist ein alternativer Ansatz zur Quantifizierung der ungebundenen Droge im Gewebe und ermöglicht genaue Quantifizierung der freien Drogen Konzentrationen erreichen extrazelluläre Populationen von Bakterien13. Jedoch würde die Technik am besten als einen komplementären Ansatz angewendet werden, wie es die räumlichen Besonderheiten der LCM-LC/MS fehlt und nur löslichen Wirkstoff Hierarchieebenen extrazelluläre Gewebeflüssigkeit, nicht der intrazellulären Inhalt quantifiziert.
Wir haben zum ersten Mal, LCM und LC/MS, räumlich Antibiotika auf dem Gelände des Tuberkulose-Infektion zu quantifizieren kombiniert. Die Methodik ist enorm mächtig, da es auf jede kleine Molekül Medikament in jedem Krankheitsstadium angewendet werden kann. In der Tat haben wir vor kurzem eine antimykotische Arzneimittelkandidat in einem Mausmodell der Abdominal-Candidiasis14quantifiziert. Differenzielle Medikament Partitionierung in heterogenen Tumor Fächer (einschließlich nekrotische Kerne) ist ein Hauptanliegen in der Behandlung von Krebs und ein kritischer Bereich der Forschung auf Krebs Medikament Entdeckung15. LCM-LC/MS ist ideal geeignet, um diese Fragen zu nähern. Darüber hinaus LCM-LC/MS eignet sich für Entdeckung von Biomarkern zu quantifizieren, Stoffwechsel-, Lipidomic und Proteomic ändert sich in Gewebe Regionen und Zell-Populationen während der Pathogenese der Krankheit auftreten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Wir danken Paul O'Brien, Marizel Mina und Isabella Freedman für Tierversuche, Jacquie Gonzalez und Danielle Weiner von NIH/NIAID für Hilfe mit Gammastrahlung von Kaninchen Gewebe vor dem Laser Capture Microdissection und Jansy Sarathy für Manuskript Gedanken und Ratschläge. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Mittel aus der Bill und Melinda Gates Foundation (OPP1174780) und NIH geteilt Instrumentierung gewähren 1S10OD018072. Wir danken Eliseo A. Eugenin für den Zugang zu den Leica LMD 6500 Mikroskop und Austausch von Wissen und Beratung. Der Kauf und die laufende Unterstützung, der LMD-6500 wurde finanziert durch das National Institute of Mental Health Grant, MH096625, National Institute of Neurological Disorders und Schlaganfall, NS105584, PHRI Mittel (für E.A.E) und GSK Beiträge (zur E.A.E).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
References
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: From blood to lesions to mycobacterial cells. Nat Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
- Roscioli, K. M., et al. Desorption electrospray ionization (DESI) with atmospheric pressure ion mobility spectrometry for drug detection. Analyst. 139 (7), 1740-1750 (2014).
- Prideaux, B., et al. Mass spectrometry imaging of levofloxacin distribution in TB-infected pulmonary lesions by MALDI-MSI and continuous liquid microjunction surface sampling. Int J Mass Spectrom. 377, 699-708 (2015).
- Griffiths, R. L., Randall, E. C., Race, A. M., Bunch, J., Cooper, H. J. Raster-mode continuous-flow liquid microjunction mass spectrometry imaging of proteins in thin tissue sections. Anal Chem. 89 (11), 5683-5687 (2017).
- Prideaux, B., Stoeckli, M. Mass spectrometry imaging for drug distribution studies. J Proteomics. 75 (16), 4999-5013 (2012).
- Dilillo, M., et al. Mass spectrometry imaging, laser capture microdissection, and LC-MS/MS of the same tissue section. J Proteome Res. 16 (8), 2993-3001 (2017).
- Xu, B. J. Combining laser capture microdissection and proteomics: methodologies and clinical applications. Proteomics Clin Appl. 4 (2), 116-123 (2010).
- Cahill, J. F., Kertesz, V., Van Berkel, G. J. Laser dissection sampling modes for direct mass spectral analysis. Rapid Commun Mass Spectrom. 30 (5), 611-619 (2016).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: A failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 110016 (2011).
- Zimmerman, M., et al. Ethambutol partitioning in tuberculous pulmonary lesions explains its clinical efficacy. Antimicrob Agents Chemother. 61 (9), (2017).
- Kempker, R. R., et al. Cavitary penetration of levofloxacin among patients with multidrug-resistant tuberculosis. Antimicrob Agents Chemother. 59 (6), 3149-3155 (2015).
- Zhao, Y., et al. Unraveling drug penetration of echinocandin antifungals at the site of infection in an intra-abdominal abscess model. Antimicrob Agents Chemother. , (2017).
- Pascal, J., et al. Mechanistic modeling identifies drug-uptake history as predictor of tumor drug resistance and nano-carrier-mediated response. ACS Nano. 7 (12), 11174-11182 (2013).
