Análisis de minerales producidos por hFOB 1.19 y Saos-2 células usando la microscopia electrónica transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía

Summary

Presentamos un protocolo para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Sus perfiles de mineralización fueron analizados por alizarina rojo-S (AR-S) coloración, visualización luz de ultravioleta (UV), la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión y microanálisis por energía dispersiva por rayos x (EDX).

Abstract

Este video presenta el uso de microscopía electrónica de transmisión con microanálisis de rayos x dispersiva de energía (TEM-EDX) para comparar el estado de los minerales en vesículas por dos líneas de células de hueso humano: hFOB 1.19 y Saos-2. Estas líneas celulares, después del tratamiento con ácido ascórbico (AA) y β-glicerofosfato (β-GP), experimentar transdifferentiation osteogénico completado de proliferación a la mineralización y producen vesículas de matriz (MVs) que provocan la nucleación de apatita en la matriz extracelular (ECM).

Basado en la tinción de rojo de alizarina-S (AR-S) y análisis de la composición de minerales en los lysates de la célula con luz ultravioleta (UV) o en vesículas usando proyección de imagen de TEM seguido por EDX cuantificación y mapeo de ion, podemos inferir que el osteosarcoma Saos-2 y osteoblástica las células hFOB 1.19 revelan perfiles de mineralización distinta. Las células SAOS-2 mineralizar más eficientemente que las células hFOB 1.19 y producen depósitos minerales más grandes que no son visibles bajo luz UV, pero son similares a la hidroxiapatita (HA) en que tienen sustituciones más Ca y F.

Los resultados obtenidos con estas técnicas nos permiten concluir que el proceso de mineralización es diferente dependiendo del tipo de célula. Proponemos que, a nivel celular, el origen y las propiedades de las vesículas predeterminan el tipo de minerales.

Introduction

El hueso es un tipo de tejido conectivo compuesto de dos partes: orgánica (células y fibras de colágeno) y minerales (compuestos de calcio y fosfato). Los principales componentes minerales en los huesos son apatitas¹. Diferentes tipos de células competentes de mineralización en el hueso (osteoblastos), dientes (odontoblastos) y cartílago (condrocitos) regulan los pasos iniciales de mineralización produciendo proteínas de la matriz extracelular (ECM) y liberación de matriz vesículas (MVs) (figura 1). MVs son vesículas de 100 a 300 nm de diámetro que acumulan calcio y fosfato facilita la nucleación de apatita y posteriormente se unen al colágeno^2,3. Entonces, MVs se desintegran para liberar apatitas al medio extracelular. Las apatitas continúan creciendo en contacto con las fibras de colágeno y forman la matriz ósea. La mineralización es sostenida por el suministro constante de P y Ca^{2 +} en el medio extracelular. Algunos datos publicados recientemente apoyan nuestro modelo^4,5. Los tejidos blandos no mineralizarse bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, la calcificación ectópica puede ocurrir en condiciones patológicas tales como calcificación vascular³. Las células vasculares que adquieren el fenotipo de osteoblastos pueden producir MVs que inducen la nucleación de apatitas e inician la mineralización en las capas íntimas y mediales de la pared de los vasos sanguíneos. Desde calcificación ectópica se asemejan a endocondral normal mineralización³, entender los mecanismos moleculares de la mineralización de las células óseas y condrocitos deben proporcionar algunas pistas sobre la calcificación ectópica de los tejidos blandos que son formado.

El desarrollo de tejidos esqueléticos está regulado por diversas enzimas, factores de crecimiento y promotores o inhibidores de la mineralización. La acción antagónica de la fosfatasa alcalina no específica de tejido (TNAP) (figura 1) y ectonucleotide pirofosfatasa/fosfodiesterasa I (NPP1), junto con ankyrin (ANK), controla la concentración de pirofosfato inorgánico (PP) ⁶. PP, un potente inhibidor de la formación de HA, es hidrolizado por TNAP; NPP1 hidroliza trifosfatos de nucleótidos para formar PP mientras ANK las exportaciones de PP de la célula al ECM. La proporción Pi/PPi puede regular la formación de apatita^7,8 con posibles consecuencias patológicas⁹.

La membrana de MV se enriquece en proteínas de transporte de iones que facilitan la precipitación inicial de calcio y fosfato en el MVs durante el proceso de nucleación (figura 1). El transportador de fosfato 1 (hoyo) ayuda a incorporar P genera en el espacio perivesicular en la MVs^10,11. Anexinas pueden estar implicado en el atascamiento y el transporte de Ca^{2 +} y en el proceso biofísico que inicia la mineralización en el MV lumen^12,13. Privilegiamos la hipótesis, sugerida anteriormente, para la mineralización dentro de vesículas intracitoplasmáticas de nucleación interna de apatita dentro de la MV antes de su propagación en el ECM^14,15. Modelado in vitro confirmaron la inducción de la Ca^{2 +}/P complejos formación en proteoliposomes de PS y AnxA5¹⁶. Esto puede indicar que la acumulación de Ca^{2 +}, P, complejos AnxA5 y PS en las balsas lipídicas de las microvellosidades-como membranesrepresent el núcleo nucleación (NC) de apatita dentro de Mvs anexinas y TNAP también poseen colágeno vinculante capacidades que pueden ayudar en la colocación de MVs a lo largo de las fibras de colágeno y en estimular la propagación de la mineralización en el ECM. Fetuin A y¹⁷de la osteopontina (OPN), son conocidos como inhibidores de la formación de apatita que puede ralentizar la propagación de la mineralización en el andamio colagenosa. Nucleación y propagación son eventos distintos, el primero anterior a éste, y ambos pueden ser relevantes para el proceso de mineralización patológica.

Para descubrir cómo puede cambiar la química de complejos de fosfato de calcio calcificación ectópica y mineralización fisiológica, es necesario identificar los minerales producidos por las células. Apatitas son un grupo de calcio y fosfato que contiene minerales con el cristal general unidad celular fórmula Ca₁₀(PO₄)₆X₂, donde X = Cl, F, OH. Se clasifican de la siguiente manera¹⁸: Fluorapatito (FA) Ca₁₀(PO₄)₆F₂y chlorapatite (CA) Ca₁₀(PO₄)₆Cl₂ de hidroxiapatita (HA) Ca₁₀(PO₄ )₆(OH)₂.

La elección de las líneas celulares de osteoblastos para inducir la formación de minerales es crucial, puesto que cada línea celular exhibe un perfil distinto de mineralización. En este informe, en comparación con la nucleación de minerales por dos modelos de células humanas las de mineralización: células osteoblásticas hFOB 1.19 y células de osteosarcoma Saos-2. Las células derivadas de osteosarcoma se utilizan comúnmente como modelos osteoblásticos y células Saos-2 conservan la más madura de carácter osteoblástico¹⁹ mientras que las células indiferenciadas hFOB fetal humano son ampliamente utilizadas como modelo para osteoblástica normal diferenciación²⁰. Sus perfiles de mineralización se analizaron mediante diferentes métodos: tinción rojo de alizarina-S (AR-S), ULTRAVIOLETA (UV) luz la visualización, la proyección de imagen de microscopía electrónica (TEM) transmisión, cuantificación de microanálisis (EDX) de rayos x dispersivo energía y ion asignación. La ventaja de TEM-EDX sobre alternativas técnicas utilizadas en estudios previos es que da resultados cuantitativos y cualitativos de la sustitución de iones en cristales de apatita^4,5,21. El objetivo de utilizar las TEM-EDX era encontrar un método simple para la proyección de imagen y cuantificación de la distribución de los iones Ca, F y Cl en varios minerales de diferentes tipos de células en distintas etapas del proceso de mineralización. Este método ha sido utilizado con éxito, por ejemplo, para monitorear la interacción de las nanopartículas de zinc con productos químicos coexistentes y sus combinados efectos en organismos acuáticos²². En otro estudio, un fotocatalizador cobre en materiales de titanio en solución acuosa se caracterizó ampliamente por medio de espectrometría de emisión óptica de plasma acoplado inductivamente (ICP-OES), N2 physisorption (BET), DRX, DRS de UV-vis, FT-IR, Raman Espectroscopia, TEM-EDX y fotoelectroquímicos medidas²³. Nuestro objetivo fue comparar el origen y las propiedades de las vesículas y los minerales en dos líneas celulares para entender el mecanismo que controla la mineralización durante la diferenciación ósea.

Figura 1 . Esquema de los pasos iniciales de la mineralización en las células óseas que implican la síntesis de proteínas de matriz extracelular (ECM) y liberación de vesículas de la matriz (MVs) de la membrana. MVs acumulan calcio a través de la acción de proteínas calcio, anexinas y fosfato, a través de la acción de un transportador de fosfato inorgánico (PiT) seguido por la actividad de tejido no-fosfatasa alcalina específica (TNAP), que desfosforila PP a P, facilitando así el nucleation de la apatita. Entonces, MVs se desintegren y liberen apatitas al medio extracelular. La mineralización es sostenida por el suministro constante de P y Ca^{2 +} en el medio extracelular^4,5. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Protocol

1. la cultura y el tratamiento de la célula Poner todos los materiales necesarios bajo la campana de flujo laminar y esterilización bajo luz UV. Los medios de cultivo son: una mezcla 1:1 del jamón de medios F12 y DMEM con 2,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de penicilina, 100 estreptomicina U/mL 0.3 mg/mL G418 y 10% suero bovino Fetal (FBS) (v/v) para antígeno de T grande de SV40 feto humano hFOB 1.19 transfectadas osteoblastos y medio de McCoy 5A 1,5 mM L-glutamina suplementada con 100 U/mL de pen…

Representative Results

TEM-EDX permite el en vitro la proyección de imagen de vesículas de la matriz (MVs) lanzadas por mineralización de las células y de los minerales producidos por Mfrente a los resultados obtenidos con esta técnica demuestran que el proceso de mineralización puede proceder de manera diferente en varios tipos de células. Las líneas dos celulares recibieron el mismo tratamiento de transdiferenciación osteoblástica, pero estimulada células Saos-2 más eficientement…

Discussion

En el documento actual, describen los protocolos para AR-S coloración, identificación de luz UV de Fluorapatito y TEM-EDX en vitro la proyección de imagen de MVs por mineralización de las células y de los minerales producidos por MVs. Es posible tratar todos los métodos mencionados siguiendo algunos pasos de solución de problemas comunes. Para obtener resultados óptimos, deben realizarse varios pasos críticos cuidadosamente. En primer lugar, es mejor añadir AA (que es ácido) seguida por β-GP…

Materials

Reagent
Ham’s DMEM/F12 media mixture	PAA	E15-813	1:1, for human fetus hFOB 1.19 SV40 large T antigen transfected osteoblasts (ATCC CRL-11372)
McCoy’s 5A medium	PAA	E82312-0025	for human osteosarcoma Saos-2 cells (ATCC HTB-85)
Antibiotics mixture (penicillin/streptomycin)	Sigma	P0781-100ML	100 U/mL each
G-418	Sigma	68168	0.3 mg/mL
FBS	Gibco	10270	10% for hFOB 1.19 and 15% for Saos-2
AA	Sigma	A-5960	50 µg/mL
ß-GP	Sigma	G9422-100G	7.5 mM
Bio-Gel HTP Gel	Bio-Rad	130-0420	for HA
FA			synthesized by us
CA			synthesized by us
Sodium phosphate buffer Na2HPO4/NaH2PO4 mixture	Sigma	S7907/S8282	0.1 M, pH 7.2
PBS			pH 7.0, prepared by us
AR-S in PBS	Sigma	A5533-25G	0.5 g/100 mL, pH 5.0
Collagenase type IA	Sigma	C2674	500 U/mL
SCL buffer			prepared by us
Deionized wather			produced by us
Ethanol	POCh	BA6480111	absolut 99.8% and solutions 25, 50, 75, 90%
Uranyl acetate in 50% ethanol	Polysciences Inc.	21447-25	0.25 g/10 mL
PD medium			pH 7.4, prepared by us
Fixation mixture (paraformaldehyde/glutaraldehyde)	Sigma	158127/G-6257	3%:1%
Post-fixation OsO4	Sigma	75633	1%
LR White resin in ethanol	Polysciences Inc.	17411-MUNC 500g	1:2, 1:1, 100%
Acetone	CHEMPUR	111024800	pure
Tool
Cryogenic vials	Corning Inc.	430487	1.2 mL
Plastic Petri culture dishes	Falcon	353003	100 mm
Plastic tubes	Falcon	352096 and 352070	15 and 50 mL
Serological pipettes	Falcon and VWR	357521 and 612-3700	1 and 10 mL
Plastic microcentrifuge tubes	Sigma	Z688312 and Z628034	1.5 mL black and 2 mL transparent
Plastic tips	VWR	613-0364, 613-0239 and 613-1050	0.1-10 µL natural, 1-200 µL yellow and 200-1000 µL blue
Plastic racks	Light Labs	A-7055-Z, A-7053-C	green for tubes, orange for micro tubes and blue for TEM probes
Laminar Hera Save	Thermo Scientific Co.	KS12	HEPA filter (H14 according to DIN EN 1822)
Incubators Hera Cell	Thermo Scientific Co.	150	34°C for hFOB 1.19 and 37°C for Saos-2
Fume hood	POLON	WCS-2	for TEM stainings
Glass bottles	SIMAX	1632414501050 and 1632414501100	50 and 100 mL
Quartz glass tubes	SIMAX	638422010100	Ø 10 mm, L 100 mm
Pump	IBS Integra Biosciences	VACUSAFE comfort	for vacuum
Oven	Memmert	UNE 400	56°C
Porcelain multi-well plate	Rosenthal technik	229/12	12 wells
Glass beakers	SIMAX	632417010025	25 mL
Glass bottles	Pocord	DIN22	10 mL
Plastic box	Agar Scientific Ltd.		for darkness
Snap Fit Gelatin Capsules	Agar Scientific Ltd.	G3741	size 1
Formvar/Carbon 300 Mesh Ni grids in box	Agar Scientific Ltd.	S162N3	film on the shiny side
Silicon cell scraper	Sigma	SIAL0010-100EA	size 1.8/25 cm
Syringe with needle	BogMark	007	syringe 1 mL 40 U, needle 0.5 x 16
Syringe	Chirana	CH005L	5 mL
Centrifuge	MPW Medical Instruments	MPW-350R	130 x g and 500 x g
UV transluminator	UVP	M-20	for visible and UV light
Ultramicrotome	LKB	NOVA	700Å sections
Block holder	LKB	E6711	round shape
Diamond knife	DiATOME	Ultra 45°	size 3
Eyelash holder			bovine, prepared by us
Forceps	ROTH	2855.1	antistatic for grids
Spatulas set	ROTH	E286.1	antistatic for powders
Imaging
Inverted Light Microscope	Zeiss with Canon	AxioObserver Z1 equipped with PowerShot G9	Phase contrast, Transmitted light, 20 x objective, RGB filters
Transmission Electron Microscope	TEM Jeol Co. with Oxford Instruments and SiS-Olympus	JEM-1400 TEM equipped with full range INCA Energy Dispersive X-ray microanalysis (EDX) System and 11 Megapixel MORADA G2 camera	magnification 50,000X for TEM and 15,000X for STEM and EDX
Camera body and lenses	Nikon	Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D	for movie recordings
Microphone	MXL Mics	Tempo	for voice recordings