중생의 연구에 대 한 기본 위 상피 단층 문화 마우스 및 인간의 파생
Summary
여기는 설정 하 고 2 차원 단층을 3D organoids의 전송에 대 한 인간 및 마우스 파생 된 3 차원 (3D) 위 organoids, 그리고 방법을 경작 하는 프로토콜에 설명 합니다. 재생 연구에 대 한 분석 결과 처음 상처를 소설로 위 상피 단층의 사용은 또한 기술 된다.
Abstract
위 상처 복구의 생체 외에서 연구는 일반적으로 세포질 확산 및 마이그레이션의 스크래치 상처 분석 결과에서 위 암 세포 라인의 사용을 포함 한다. 그러나 이러한 분석의 한 가지 중요 한 한계는, 그들의 균질 성 다양 한 세포 종류입니다. 복구는 여러 종류의 세포 상호 작용을 요구 하는 복잡 한 프로세스입니다. 따라서, 세포 하위, 없는 문화 공부를 우리가 복구 프로세스를 이해 하 고 있다면 극복 되어야 하는 관심사 이다. 위 organoid 모델에 의하여 세포 유형의 이기종 컬렉션 밀접 하 게 위 상피 또는 다른 기본 조직 비보의 반영이 문제를 완화 수 있습니다. 여기는 소설, 스크래치 상처 시험 생체 외에서 인간에서 파생 된 증명 또는 마우스 3 차원 organoids 다음으로 옮겨질 수 위 상피 단층 중 그대로 organoids 또는의 단일 세포 현 탁 액으로는 해리 organoids입니다. 프로토콜의 목적은 organoid 파생 된 위 상피 monolayers 위 재생 연구 소설 스크래치 상처 분석 결과 시스템에서 사용할 수 있는 설정입니다.
Introduction
처음 상처 분석 실험의 사용 수리 및 재생1,2,,34,,56공부에 대 한 인기 있는 방법입니다. 특별히 위 중생과 헬리코박터 파일로리 식민지 연구 제안 된 방법론을 사용할 수 있습니다. 과거에는, 위 암 세포 선 헬리코박터 파일로리 (헬리코박터) 감염1,2 를 공부 하는 수단으로 사용 되었습니다 했으며 최근 위 암까지 AGS 셀 등 셀 라인 선호1 ,2,,34. 위 암 세포 배양의 한계가 정리 위 상피의 세포 다양성에 그들의 실패 이다. 이 한계를 해결 하려고 하 시연 설립 및 기본 인간 및 마우스 파생 3 차원 fundic 위 organoids (FGOs)의 이동은 여기 먼저 수정 된 방법에 따라 상처 치유 분석 실험에 대 한 위 상피 단층을 Schlaermann 외에의해 설명. 7 위 상피 monolayers에서 파생 된 전단 3D 위 FGOs 또는 단일 셀 FGO 파생 된 유지 밀접 하 게 위 상피의 나타내는 편광된 세포 구성 시연 vivo에서. 위 암 셀 라인 팬 들은이 기술을 표시 셀 구성의 정보를 입증 하지 않습니다, 그는 현재 프로토콜 대체 스크래치 상처 분석 방법에 비해 장점이 있다. 이 방법론은 해리 organoids에서 단일 세포 현 탁 액 또는 전체 organoids에서 설립 하 고 지하실 멤브레인 매트릭스를 사용 하 여 도금 또는 콜라겐 코팅 monolayers 수 면 최적화 되었습니다. 이 프로토콜의 전반적인 목표는 organoid 파생 된 위 상피 단층 문화 소설 상처 치유 분석 결과 대 한 설정입니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
현재 프로토콜 세부 인간 및 마우스 파생 된 위 상피 monolayers 스크래치 상처 분석 실험을 위해 사용 될 수 있는 설립. 프로토콜 주민 줄기 세포 주 인간 (또는 마우스)에서 절연 조직의 개념에 의존 하 고는 수정 된 프로토콜 처음 발행 Schlaermann 외7. 특히, 우리는 합칠 확립 여기 프로토콜을 최적화 하 고 어떤 표현 주요 세포 계보 vivo에서위 상피 내에서 찾을 수 있는 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 NIH (NIDDK) 5에 의해 지원 되었다 R01 DK083402-07 부여 (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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