Abgeleitet von Maus und Mensch primäre gastrische Epithelzellen Monolayer Kultur for the Study of Regeneration
Summary
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Einrichtung und Kultivierung von Mensch und Maus abgeleitet 3-dimensionale (3D) Magen Organellen und die Methode für die Übertragung von 3D Organellen auf eine 2-dimensionale monomolekularen Film. Die Verwendung von Magen epithelialen Monolage als eine neuartige Kratzer-Wunde-Assay für Regeneration Studien wird ebenfalls beschrieben.
Abstract
In-vitro- Studien der Magen Wunde Reparatur umfasst in der Regel die Verwendung von Magenkrebs Zell-Linien in einem neu-Wunde-Assay der zelluläre Proliferation und Migration. Eine kritische Einschränkung solcher Tests ist jedoch ihre homogene Sortiment von zellulären Arten. Reparatur ist ein komplexer Prozess, der die Interaktion der verschiedenen Zelltypen verlangt. Daher geht um eine Kultur zelluläre Subtypen zu studieren, die überwunden werden müssen, wenn wir die Reparatur-Prozess zu verstehen. Das Magenband organoide Modell kann dieses Problem beheben, wobei die heterogene Sammlung von Zelltypen, die den Magen Epithel oder anderen nativen Gewebe in Vivoentspricht. Gezeigt, hier ist ein Roman, in-vitro- Kratzer-Wunde Assay abgeleitet von Mensch oder Maus 3-dimensionale Organellen, die dann auf eine gastrische Epithelzellen Monolage als entweder intakten Organellen oder als einzelne Zelle Aussetzung der übertragen können getrennt Organellen. Das Ziel des Protokolls ist, organoide abgeleitet gastrische Epithelzellen Monolagen zu etablieren, die in einem Roman Kratzer-Wunde-Assay-System einsetzbar, um Magen-Regeneration zu studieren.
Introduction
Die Verwendung von Grund auf neu-Wunde-Assays ist eine beliebte Methode zur Untersuchung von Reparatur und Regeneration1,2,3,4,5,6. Die vorgeschlagene Methode kann verwendet werden, insbesondere Magen-Regeneration und Helicobacter Pylori Besiedlung zu studieren. In der Vergangenheit Magenkrebs Zelllinien als Mittel verwendet wurden, um Helicobacter Pylori (H. Pylori) Infektion1,2 studieren und Zell-Linien wie AGS Zellen waren bis vor kurzem Magenkrebs favorisierte1 ,2,3,4. Eine Einschränkung der Magenkrebs Zellkulturen ist ihrer Nichtbeachtung die zelluläre Vielfalt der Magen Epithel zu rekapitulieren. Zu versuchen, diese Einschränkung Adresse gezeigt, hier ist die Errichtung und die Übertragung der primären Mensch und Maus abgeleitet 3-dimensionale fundic Magen Organellen (FGOs), ein Magen epithelialen Monolage für Wunde heilende Assays basieren auf einer modifizierten Methode zuerst von Schlaermann Et al.beschrieben. 7 wir zeigen, dass Magen epitheliale Monolagen abgeleitet 3D Magen FGOs geschert oder FGO abgeleitet Einzelzellen behalten eine polarisierte zelluläre Zusammensetzung, die eng, die der Magen Epithel darstellt in-vivo. Angesichts der Tatsache, dass Magenkrebs Zelllinien keine Zelle Zusammensetzung, die diese Technik zeigt erkennen lassen, hat das aktuelle Protokoll einen Vorteil gegenüber alternativen Kratzer-Wunde-Assay-Methoden. Diese Methodik wurde optimiert, wobei Monolagen etablierten aus ganzen Organellen oder aus einer einzelnen Zelle Suspendierung vom dissoziierten Organellen und überzogen mit einer Basalmembran Matrix oder Kollagen-Beschichtung werden können. Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist es, festzulegen, dass eine organoide gastrische Epithelzellen Monolage Kulturen für einen neuartigen Wunde heilende Assay abgeleitet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das aktuelle Protokoll beschreibt die Einrichtung von Mensch und Maus abgeleitet gastrische Epithelzellen Monolagen, die für neu-Wunde Assays verwendet werden können. Das Protokoll hängt das Konzept der ansässigen Stammzellen isoliert von primären Mensch (oder Maus) Gewebe und ist ein modifiziertes Protokoll zuerst veröffentlicht durch Schlaermann Et al.7. Insbesondere haben wir das Protokoll hier so optimiert, dass ein Zusammenfluss etablieren und polarisiert gastrische Epithelzell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde unterstützt von der NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 (YZ) zu gewähren.
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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