Souris - et anthropique de Culture monocouche épithéliales gastriques primaire pour l’étude de la régénération
Summary
Nous décrivons ici un protocole pour l’établissement et la mise en culture-anthropique et souris 3 Dimensions (3D) organoïdes gastrique et la méthode de transfert d’organoïdes 3D à une monocouche 2 dimensions. L’utilisation de la couche épithéliale gastrique comme un nouveau dosage zéro-plaie pour études de régénération est également décrite.
Abstract
Des études in vitro de cicatrisation gastrique implique généralement l’utilisation de lignées cellulaires de cancer de l’estomac lors d’un essai de zéro-plaie de la prolifération cellulaire et migration. Une restriction critique de ces tests, cependant, est leur assortiment homogène des types cellulaires. La réparation est un processus complexe qui exige de l’interaction de plusieurs types de cellules. Par conséquent, afin d’étudier une culture dépourvue de sous-types cellulaires, est une préoccupation qui doit être surmontée si l’on veut comprendre le processus de réparation. Le modèle organoïde gastrique peut atténuer ce problème, auquel cas la collection hétérogène de types cellulaires reflète fidèlement celle de l’épithélium gastrique ou d’autres tissus natifs in vivo. Montré ici est un roman, un essai in vitro zéro-plaie avec dérivée de l’homme ou la souris organoïdes 3 dimensions qui peuvent ensuite être transférées à une monocouche épithélium gastrique soit organoïdes intact ou comme une suspension monocellulaire de dissocié organoïdes. L’objectif du protocole est d’établir des monocouches gastriques épithéliales dérivées organoïde qui peuvent être utilisés dans un système nouveau dosage zéro-plaie pour étudier la régénération gastrique.
Introduction
L’utilisation des dosages de zéro-plaie est une méthode populaire pour étudier la réparation et la régénération1,2,3,4,5,6. La méthodologie proposée peut servir à étudier spécifiquement la régénération gastrique et la colonisation de l’Helicobacter pylori . Dans le passé, lignées cellulaires de cancer de l’estomac ont été utilisées comme un moyen d’étudier l’ Helicobacter pylori (H. pylori) infection1,2 et jusqu’à cancer gastrique récemment lignées cellulaires comme les cellules AGS étaient favorisés1 ,2,3,4. Une des limites des cultures de cellules de cancer gastrique est leur incapacité à récapituler la diversité cellulaire de l’épithélium gastrique. Pour tenter de combler cette lacune, démontré qu’ici, c’est la création et le transfert de primaire-origine humaine et souris 3-dimensional fundus gastrique organoïdes (FGOs) à une monocouche épithéliale gastrique pour blessure des dosages guérison basée sur une méthode modifiée tout d’abord décrite par Schlaermann et al. 7 nous démontrons que des monocouches épithéliales gastriques dérivés cisaillement 3D FGOs gastriques ou FGO-dérivés des cellules individuelles conservent une composition cellulaire polarisée qui représente fidèlement celle de l’épithélium gastrique in vivo. Étant donné que les lignées cellulaires de cancer de l’estomac ne démontrent pas la composition de la cellule qu’affiche cette technique, le protocole actuel a un avantage sur les méthodes alternatives zéro-plaie. Cette méthodologie a été optimisée par lequel monocouches peuvent être établie à partir d’organoïdes entier ou d’une suspension monocellulaire d’organoïdes dissocié et plaqué à l’aide d’une matrice de la membrane basale ou collagène-revêtement. L’objectif général du présent protocole est d’établir qu’un organoïde provenant des cultures monocouches épithéliales gastriques pour un dosage de guérison de blessure de roman.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le protocole actuel détaille la mise en place de monocouches gastrique épithéliales-anthropique et souris qui peut être utilisé pour des dosages de zéro-plaie. Le protocole repose sur le concept des tissus d’isolement primaire humain (ou souris) résident de cellules souches et est un protocole modifié publié par Schlaermann et al.7. En particulier, nous avons optimisé le protocole ici pour établir un confluent et polarisé gastrique monocouche épithélial qui exprime les gra…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 accorder (YZ).
Materials
| Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
| GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
| Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
| Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
| HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
| n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
| BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
| Gastrin | Tocris | 3006 | |
| EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
| FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
| Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
| TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
| Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
| Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
| Fetal Bovine Serum | FBS | ||
| OPTIMEM | Invitrogen | ||
| 0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
| 37 °C Water Bath | |||
| Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
| Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
| 125 mL round bottom flask | |||
| 1 in (25 mm) stir bar | |||
| Rubber Septa | |||
| Sterile Gauze | |||
| Stir Plate | |||
| Ring Stand | |||
| Ring Stand Clamps | |||
| Sterile petri dish | |||
| 18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
| 20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
| 12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
| Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
| Sterile Razor Blades | |||
| Wide-tip tweezers | |||
| Curved Hemostatic Forceps | |||
| 200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
| 5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
| Oxygen Tank with rubber hosing | |||
| 1 g D-Sorbitol | |||
| Sucrose | Fisher | SS-500 | |
| Dissecting microscope | |||
| Dissecting Tray | |||
| Rocking Table | |||
| Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
| Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
| Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
| 2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
| 12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
| Cell scraper | Corning | 353086 | |
| Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
| 263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
| Razor blade | |||
| L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
| HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
| HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
| E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
| UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
| Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |
References
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