यहां हम स्थापित करने और मानव संवर्धन और माउस के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन 3 आयामी (3 डी) गैस्ट्रिक organoids, और 3 डी organoids के हस्तांतरण के लिए एक 2-आयामी monolayer के लिए विधि व्युत्पंन । पुनर्जनन अध्ययन के लिए एक उपंयास खरोंच घाव परख के रूप में गैस्ट्रिक उपकला monolayer का उपयोग भी वर्णित है ।
गैस्ट्रिक घावों की मरंमत के इन विट्रो में अध्ययन आमतौर पर सेलुलर प्रसार और प्रवास के एक खरोंच घाव परख में गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों का उपयोग शामिल है । ऐसे परख की एक महत्वपूर्ण सीमा है, तथापि, उनके सेलुलर प्रकार के समरूप वर्गीकरण है । मरंमत एक जटिल प्रक्रिया है जो कई प्रकार के सेल की बातचीत की मांग है । इसलिए, एक सेलुलर उपप्रकार से रहित संस्कृति का अध्ययन करने के लिए, एक चिंता का विषय है कि अगर हम मरंमत की प्रक्रिया को समझ रहे है दूर किया जाना चाहिए है । गैस्ट्रिक organoid मॉडल इस मुद्दे को कम कर सकते है जिससे कोशिका प्रकार के विषम संग्रह को दर्शाता है कि गैस्ट्रिक उपकला या vivo मेंअंय देशी ऊतकों की । यहां का प्रदर्शन एक उपंयास है, इन विट्रो में खरोंच-घाव मानव या माउस से व्युत्पंन परख 3 आयामी organoids जो तब एक गैस्ट्रिक उपकला monolayer को या तो बरकरार organoids या असंबद्ध के एक सेल निलंबन के रूप में स्थानांतरित किया जा सकता organoids । प्रोटोकॉल का लक्ष्य organoid-व्युत्पंन गैस्ट्रिक उपकला monolayers है कि एक उपंयास खरोंच में इस्तेमाल किया जा सकता है घाव परख प्रणाली गैस्ट्रिक पुनर्जनन अध्ययन करने के लिए स्थापित करने के लिए है ।
खरोंच घाव परख का उपयोग मरंमत और पुनर्जनन1,2,3,4,5,6के अध्ययन के लिए एक लोकप्रिय तरीका है । प्रस्तावित पद्धति का उपयोग गैस्ट्रिक पुनर्जनन और Helicobacter हेलिकोबेक्टर औपनिवेशीकरण के लिए विशेष रूप से अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है । अतीत में, गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों का अध्ययन करने के लिए एक साधन के रूप में इस्तेमाल किया गया है Helicobacter हेलिकोबेक्टर (एच. हेलिकोबेक्टर) संक्रमण1,2 और हाल ही में जब तक गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों जैसे AGS कोशिकाओं इष्ट थे1 ,2,3,4. गैस्ट्रिक कैंसर सेल संस्कृतियों की एक सीमा उनके गैस्ट्रिक उपकला के सेलुलर विविधता दोहराऊंगा विफलता है । इस सीमा को संबोधित करने की कोशिश करने के लिए, यहां का प्रदर्शन किया स्थापना और प्राथमिक मानव के हस्तांतरण-और माउस व्युत्पंन 3 आयामी एक संशोधित विधि के आधार पर घाव भरने की परख के लिए एक गैस्ट्रिक उपकला monolayer के लिए organoids (FGOs) पहले Schlaermann एट अलद्वारा वर्णित है । 7 हम प्रदर्शन कि गैस्ट्रिक उपकला monolayers कतरनी 3 डी गैस्ट्रिक FGOs या FGO-व्युत्पन्न एकल कोशिकाओं से व्युत्पंन एक ध्रुवीय सेलुलर रचना है कि बारीकी से vivo में गैस्ट्रिक उपकला का प्रतिनिधित्व करता है बनाए रखने. यह देखते हुए कि गैस्ट्रिक कैंसर सेल लाइनों सेल संरचना इस तकनीक को प्रदर्शित नहीं करता है, वर्तमान प्रोटोकॉल वैकल्पिक खरोंच पर एक फायदा है-घाव परख तरीकों । इस पद्धति को अनुकूलित किया गया है जिससे monolayers पूरे organoids से या असंबद्ध organoids से एक ही सेल निलंबन से स्थापित किया जा सकता है और एक तहखाने झिल्ली मैट्रिक्स या कोलेजन-कोटिंग का उपयोग कर चढ़ाया । इस प्रोटोकॉल के समग्र लक्ष्य एक उपंयास घाव भरने परख के लिए एक organoid व्युत्पंन गैस्ट्रिक उपकला monolayer संस्कृतियों की स्थापना है ।
वर्तमान प्रोटोकॉल विवरण मानव की स्थापना और माउस व्युत्पंन गैस्ट्रिक उपकला monolayers कि खरोंच के लिए इस्तेमाल किया जा सकता घाव परख । प्रोटोकॉल प्राथमिक मानव (या माउस) ऊतकों से निवासी स्टेम सेल अलगाव की अवधा?…
The authors have nothing to disclose.
इस काम को NIH (NIDDK) 5 R01 DK083402-07 ग्रांट (YZ) द्वारा सपोर्ट किया गया ।
Advanced Dulbecco's modified Eagle/F12 medium (basal media) | Life Technologies | 12634-010 | |
GlutaMAX (L-glutamine) | Life Technologies | 25030-081 | |
Penicillin/Streptomycin | Thermo Scientific | SV30010 | |
Amphotericin B/Gentamicin | Thermo Scientific | R01510 | |
Kanamycin | Thermo Fisher | RO1510 | |
HEPES Buffer | Sigma Aldrich | H0887 | |
n-Acetylcystine | Sigma Aldrich | A9165 | |
N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
B27 | Life Technologies | 12587-010 | |
BMP Inhibitor (Noggin) | Pepro Tech | 250-38 | |
Gastrin | Tocris | 3006 | |
EGF | Pepro Tech | 315-09 | |
FGF10 | Pepro Tech | 100-26 | |
Nicotinamide | Sigma Aldrich | N0636 | |
Y-27632 ROCK Inhibitor | Sigma Aldrich | Y0503 | |
TGF-β Inhibitor | Tocris | 2939 | |
Ca2+/Mg2+ -free DPBS | Fisher | 21-031CV | |
Dulbecco's modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 12634-010 | |
Fetal Bovine Serum | FBS | ||
OPTIMEM | Invitrogen | ||
0.22µM filter | Fisher | 099-720-004 | |
37 °C Water Bath | |||
Collagenase Type 1 | Worthington | LS004214 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Kimwipes (tissue paper) | Fischer Scientific | 06-666C | |
125 mL round bottom flask | |||
1 in (25 mm) stir bar | |||
Rubber Septa | |||
Sterile Gauze | |||
Stir Plate | |||
Ring Stand | |||
Ring Stand Clamps | |||
Sterile petri dish | |||
18 G needles of 1.5 in length | Thermo Fisher | 305196 | |
20 G spinal needles of 3.5 in length | Thermo Fisher | 405182 | |
12-well cell culture treated plate | Midwest Scientific | 92012 | |
Growth Factor Reduced, Phenol Red-free MatrigelTM (Basement membrane matrix) | Fisher | CB-40230C | |
Sterile Razor Blades | |||
Wide-tip tweezers | |||
Curved Hemostatic Forceps | |||
200 µL wide pipette tips | Thermo Fisher | 02-707-134 | |
5 mL cell culture test tubes | Fisher | 14-956-3C | |
Oxygen Tank with rubber hosing | |||
1 g D-Sorbitol | |||
Sucrose | Fisher | SS-500 | |
Dissecting microscope | |||
Dissecting Tray | |||
Rocking Table | |||
Rat Tail Collagen Type 1 | Life Technologies | A10483-01 | |
Cell culture grade glacial acetic acid | Fisher | A38-212 | |
Cell culture grade water | Corning | 25-055-CV | |
2-well chamber slide | Thermo Fisher | 155380 | |
12-well Transwell (polyester membrane inserts) | Corning | 3460 | |
Cell scraper | Corning | 353086 | |
Accutase (cell detachment solution) | Stemcell Technologies | 7920 | |
263/8 G syringe | Thermo Fisher | 309625 | |
Razor blade | |||
L Cells | L cells, a Wnt3a producing cell line, were received as a gift from Dr. Hans Clevers (Hubrecht Institute for Developmental Biology and Stem Cell Research, Netherlands). | N/A | |
HEK-293T Rspondin secreting cells | A modified HEK-293T R-spondin secreting cell line was obtained from Dr. Jeff Whitsett (Section of Neonatology, Perinatal and Pulmonary Biology, Cincinnati Children's Hospital Medical Centre and The University of Cincinnati College of Medicine, Cincinnati, USA ). | N/A | |
HK-ATPase Primary Antibody | Invitrogen | SC-374094 | |
E-Cadherinn | SantaCruz | sc-59778 | |
UEA1 | Sigma Aldrich | L9006 | |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher | H3570 | |
Alexafluor 488 secondary antibody (Donkey anti-mouse 488 secondary antibody) | ThermoFisher Scientific | R37114 |