Summary
In situ bioindications aktiverer fastsettelse av hensiktsmessigheten av et miljø for truede musling arter. Vi beskriver to metoder basert på juvenile eksponering for ferskvann perle blåskjell i bur næringsfattig elven habitater. Begge metodene er implementert i varianter for åpent vann og hyporheic vann miljøer.
Abstract
Kunnskap om habitat egnethet for ferskvann blåskjell er et viktig skritt i bevaring av truede arter gruppen. Vi beskriver en protokoll for å utføre i situ juvenile eksponering testene i næringsfattig elven nedbørfelt en måned og tre måneders perioder. To metoder (i begge modifikasjoner) presenteres for å evaluere juvenile vekst og overlevelse hastigheten. Metodene og modifikasjoner varierer i verdi for lokalitet bioindication og hver har sin fordeler samt begrensninger. Sandstranden bur metoden arbeider med et stort antall individer, men bare noen av individene måles og resultatene evalueres i bulk. I metoden mesh bur enkeltpersoner blir holdt og separat, men en lav individuelle tall evalueres. Åpent vann eksponering endringen er relativt enkel å bruke; Det viser juvenile vekst potensialet av nettsteder og kan også være effektive for vann toksisitet testing. I seng eksponering endring trenger en høy arbeidsbelastning men nærmere vilkårene for juvenile naturomgivelsene og det er bedre for rapportering virkelige hensiktsmessigheten av lokaliteter. På den annen side, trengs mer replikeringer i denne endringen på grunn av dens høy-hyporheic miljø variasjon.
Introduction
Eksponering av eksperimentelle organismer i situ med påfølgende evalueringen av deres tilstand er en mulig måte å få informasjon om miljøkvaliteten og (spesielt) nettstedet egnetheten for Art. I dyr gjelder slik bioindication hovedsakelig for små virvelløse dyr som kan leve i en begrenset grenser plass. Unge stadier av annet muslinger (muslinger) er en slik egnet organisme gruppe1.
Annet muslinger av familien Unionidae er en svært viktig komponent av akvatiske økosystemer2. Men disse artene er ofte kritisk truet, spesielt i bekker og elver. Noen av dem karakteriseres som 'paraply Art' Hvis bevaring er nært knyttet til bevaring av hele strømmen naturtypen og som krever en omfattende tilnærming3. Disse dyrene har en livssyklus som er knyttet til mange miljø komponenter fra vann kjemi4,5 endringer i bestander av fisk som fungerer som blåskjell Larvene verter6. Fordi blåskjell yngel ofte representerer en kritisk fase av levetid blåskjell, er nettstedet egnetheten for deres utvikling på dette stadiet avgjørende for en vellykket arter befolkningsutvikling i en by.
Den ferskvann perle mussel (FWPM, en studie av en studie av; Unionida, muslinger) er en kritisk truede bivalve forekommer næringsfattig europeiske bekker. Deres tall har falt drastisk under 20århundre i forekomsten området . Det synes at dagens nedgang i arter gjengivelse i fleste av de sentrale europeiske befolkningene er hovedsakelig forårsaket av svært lav til null overlevelse av yngel under de første årene av livet. Det antas at juvenile FWPMs bor i mange år i grunne hyporheic sonen7, som forholdene og deres variasjon ikke er fortsatt godt beskrevet. Videre til sitt andre år av livet har vaksen bare en dimensjon av opp til ca 1 mm, så de er veldig vanskelig å finne i store mengder sedimenter under naturlige forhold8. Eksperimenter med fange yngel er derfor nødvendig for studier av deres økologi.
I tsjekkiske handlingsplanen for ferskvann Pearl blåskjell9, det er tusenvis av yngel stigende hvert år fra et halvt naturlig avlsprogram. Likevel er det et spørsmål som lokaliteter og habitater er egnet for vellykket befolkningen støtter disse yngel eller eventuell arter gjeninnføring. In situ bioindications presentere en måte å finne svaret.
Til tross for at inkonsekvent overlevelse av juvenile blåskjell i eksponering bur ble observert i noen tidligere verk som stilte spørsmål ved hensiktsmessigheten av juvenile blåskjell som bioindicators10, flere nyere studier har bekreftet den anvendelse av juvenile eksponering vannkvalitet testing11,12,13. I tillegg har det vist seg at flere faktorer må vurderes når tolke resultatene av disse bestemt studier, som de lager opprinnelse14 og vedvarende effekten av larver forhold15.
Spørsmålet melder seg på hvordan å installere eksperimentelle yngel i testet lokaliteter og mest effektivt vurdere tilstanden deres. Den første strenge anvendelsen av i situ eksponering metoder med juvenil FWPMs ble publisert av Buddensiek16. Juvenile FWPM personer ble holdt i ark bur, eksponert i fri flyt vann i bekker, og deres overlevelse og vekst kvantifisert etter flere uker av eksponering. Tilnærming ble opprinnelig utviklet som en semi kunstig formering metoden, men forfatteren også fremhevet brukbarheten for vurdering av habitat krav og vannkvalitet. Selv om FWPM juvenile overlevelse er naturligvis svært lav på en skala fra måneder/år og bare et lite antall dyr vil overleve, overlevelse kan være en god markør på en skala fra flere uker16miljømessige effekt. Over år med forskning, ble eksponering metoder utviklet videre hold eksperimentelle juvenile blåskjell i-stream habitater og evaluere deres vekst og overlevelse priser; Disse inkluderer sandstranden boksene17, blåskjell siloer basert på en oppvelling prinsippet18og ulike andre eksponering bur (sammenfattet etter tyggis og kolleger)11. Fordi barn skje naturlig i grunne hyporheic sonen7, er anvendelse av eksperimentelle enheter strømmen bunnen veldig ønskelig.
I vår artikkel, beskriver vi bruk av to eksponering enheter for FWPMs: jeg) endret Buddensiek ark bur ("mesh bur") også aktivere bioindication i hyporheal forhold; og ii) Hruška sandstranden bokser ("sandstranden bur"). Protokollen beskriver bruk av begge metodene i åpent vann og hyporheic forhold (dvs., fire varianter av eksponering er beskrevet). Metodene ble gradvis endret og utvidet mer enn 15 år i programmet i tsjekkiske handlingsplanen for ferskvann Pearl blåskjell9 og bekreftet av en rekke eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. mesh bur
Merk: Se figur 1.
- Forberede materiale
- Forberede materialet for i-laboratoriet del av eksperimentet: ~ 1-2 L av vann per mesh bur, mesh bur (1 plast hoveddelen, 2 plast dekker, 2 ark med spesielle tekniske sikter med 340 µm porene, 4 bolter og 4 nøtter per bur), tang , en skiftenøkkel, Pasteur Pipetter, en sil, et digitalt kamera, en trinocular dissekere zoom stereo mikroskop, et kalibrering rutenett (mikroskop utstyr), 5 Petri retter 50 mm diameter, kanner, 2 plast retter (~ 25 cm x 15 cm x 3 - 5 cm), og en plast.
- For å utføre hyporheal installasjonen, Forbered en gummi slangen og en 100-µm-pore mesh, og en sprøyting flasken. For bygging av enheten, se supplerende fil 1: S.1. Mesh burene bygging.
- Samle bunnen og sentrale delen av mesh merdene. Montere delen av byrået som inneholder personer. Sett en plastdekselet først så ett ark av plast sil, og til slutt viktigste kropp på toppen. Bruk fire skruene for å sikre den.
- Forberede biologisk materiale
- Sette mesh buret i plast parabolen som inneholder elvevannet. Kontroller at kamrene er halvfull. Ta FWPM yngelen (se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale) ut av boksen termisk isolert og sette dem i Petriskål.
Merk: Kontroller at plutselige temperaturendringer ikke overskrider ~ 2 ° C. - Bruke en sprøyting flasken og sil, sile gjennom vaksen fjerne detritus.
- Sette mesh buret i plast parabolen som inneholder elvevannet. Kontroller at kamrene er halvfull. Ta FWPM yngelen (se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale) ut av boksen termisk isolert og sette dem i Petriskål.
- Angi mikroskop og kameraet. Utføre en kalibrering av instrumentene (se supplerende fil1: S. 5. Mikroskop og phototechnics). Plass en Petriskål med litt vann under mikroskopet.
- Sette yngelen i merder (eksperimentell laboratoriearbeid)
- Bruk en Pasteur pipette fjerne en person fra en Petriskål og forsiktig plassere den i Petriskål under mikroskopet.
- Se individuelle fitness ved ser inn i okularet (~ 40 X forstørrelse).
Merk: "God" fitness betyr at enkelt flytter, roterer fra side til side, skyver foten ut av skallet, etc. fjerne død eller lav fitness individer med en Pasteur Pipetter og plassere dem i en egen Petriskål (FWPM yngel med åpnet skall, ingen bevegelse, foten er ikke trukket ut, en fragmentert skall, yngel som flyter ukontrollert i vannet, en synlig nedbryting av skallet, delvis Avkalking). - Ta to bilder av en FWPM personlige viser god fitness bruker en konstant forstørrelse ~ 80 X. Se supplerende filen 1: S.5. Mikroskop og phototechnics. Lagre bildene.
Merk: For en god måling av sin lengde, juvenile forvaring må legges på langs (lateral visning). Hovedmålet er å ta en høy kvalitet bilde av maksimal shell lengden god nok til å aktivere en bilde analyse etterpå. - Sett inn juvenile forvaring i riktig kammeret i bur når bildene er tatt. Registrere antall bilder og kammeret.
- Gjenta dette trinnet med hver enkelt for alle brukte kamrene i mesh buret.
Merk: se supplerende fil 1: S.1. Mesh burene bygging. - Når alle brukte kamrene har perle blåskjell, satte plast silen buret, så forsiktig oppføre plastdekselet og sikre alle deler sammen med nøtter.
- I en installasjon i en hyporheic-sone, passere en av slange gjennom en av kamre og fikse det i denne posisjonen, og ta anti-tilstopping mesh og binde den på bunnen (se supplerende fil 1: S.1. Mesh burene bygging).
- Store yngel
- Sette buret i plast boksen med elva vann, slik at yngelen er helt oppslukt, og holde det i thermobox. Før installasjonen, la yngelen tilpasse seg i situ elva temperaturen på installasjonsstedet (gradvis kjøling, maks 5 ° C i 24).
- Installere mesh burene
- Klargjør feltet materialet inkludert mesh merdene med vaksen, stål pigger, bolter og metall nøtter, en skiftenøkkel, feltet temperatur dataloggers (se Tabell for materiale og supplerende fil 1: S.4.2. Vann måling), en streng, en kameraet, feltet protokollen, en hammer, og en spade.
- Transportere FWPM yngelen til området i et felt thermobox (isolert boks), holde en stabil vanntemperaturen med variasjoner < ~ 2 ° C. Sette thermobox med mesh merdene i elva på området la yngelen tilpasse seg miljøforholdene (pH, ledningsevne, osv.).
- Installere mesh buret.
- Fjern mesh buret fra feltet thermobox. Gi den med to stål spikes og sy feltet datalogger. Anchor buret i et habitat med typisk for FWPMs i dette området (f.ekspå kanten av den viktigste stream flyten, ikke i direkte vannstrømmen, ikke i stående vann, ikke i direkte sollys).
- For åpent vann, med en stål toppene, fikse buret elven nederst; lå det på sin side og nivå med elven bunnen, nedstrøms i en vinkel på 45° til elva flyt, mot midten av elva. Den nederste horisontale kanten bør være ca 10-15 cm over elven bunnen overflaten. Opprettholde et minimum avstand på 2 m mellom hver bur på ett sted (se supplerende fil 1: S.4. Bur vedlikehold).
- For hyporheic sonen, grave merdene i elven nederst i en vinkelrett liggende posisjon, vinkelrett strømmen av vann, slik at den vannrette overkanten av byrået er parallell til elven bunnen og kamrene er plassert på hyporheic dybden som skal testes. Ta ut den øverste enden av gummi slangen over at undersiden for muligheten av vann prøvetaking under eksperimentet (se supplerende fil 1: S.4.2. Vann måling).
Merk: Det anbefales å utføre regelmessige kontroller og vedlikehold innfesting (se supplerende fil 1: S. 4. Bur vedlikehold).
- Fjern mesh buret fra feltet thermobox. Gi den med to stål spikes og sy feltet datalogger. Anchor buret i et habitat med typisk for FWPMs i dette området (f.ekspå kanten av den viktigste stream flyten, ikke i direkte vannstrømmen, ikke i stående vann, ikke i direkte sollys).
- Avinstaller merdene og transportere yngelen etter eksponering. For dette, trekk merdene ut av vannet, fjerne dem av fine sediment så vel som drev materiale og sette dem inn i feltet thermobox fylt med elvevann. Transportere merdene umiddelbart til laboratoriet og starte dødelighet og vekst rate evalueringen.
Merk: Se supplerende filen 1: S.3. Eksponering varigheten. Ved en temperaturforskjell på mer enn 5 ° C mellom merdene og laboratoriemiljø er det første nødvendig å la temperaturen utjevne. - Evaluere eksperimentet ved å sjekke livet/egnethet av hver yngel (se trinnene 1.5.2 og 1.5.3) og ta 2 bilder av hver live yngel i en Petriskål bruker en konstant forstørrelse ~ 80 X. Registrere fitness og antall bilder og kamre.
- Fullføre eksperimentet (felles til alle metoder)
- Utføre målinger i analyseprogramvare. Bruk image analyseprogramvare for kroppen størrelse fastsettelse av hver evaluerte juvenil på begge inn bildene (trinn 1.5.3) og resultatet bildene (trinn 1,9). Bruk den maksimale totale shell lengden registrert i både fotografier som kroppen størrelse verdier i både input- og output.
- Sett inn måleverdiene i tabellen prosessoren og beregne økningen (%) for hver gjenlevende juvenile.
- Anslå overlevelse (%) per mesh bur med forholdet mellom antall gjenlevende enkeltpersoner å alle eksperimentelle individer i nett buret.
Merk: Etter eksperimentet, returnere overlevende til avlsprogrammet
(se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale).
2. Sandy bur
Merk: Se figur 2.
- Forberede materiale
- Forberede materialet for i-laboratoriet del av eksperimentet: 2 Petri retter (diameter ~8.5 cm), Pasteur Pipetter, en sil, 25 L elvevann, en plastikk boks, sikter (maske størrelse 1 og 2 mm), en stor plastboks (25 L), en sandstrand kortrammen (se supplerende fil 1 : S.2. Sandy bur bygging), et digitalt kamera, en trinocular dissekere zoom stereo mikroskop, et kalibrering rutenett (mikroskop utstyr), sortert elva sand fra området (se trinn 2.1.3), og protokollen. Se tabellen av materialer og supplerende filen 1: S. 2. Sandy bur bygging.
- Utarbeide materiale for isolasjon prosessen: runde containere (1 for hver bur pluss 1 ekstra), 2 Petri retter (diameter ~ 14 cm), en Pasteur pipette, forstørrelsesglass og 1 L elvevannet.
- Sile elva sand gjennom en 2 mm sil og deretter gjennom en sil 1 mm å få en kornstørrelse på 1-2 mm. tørr sand og lagre den i en tørr form til nødvendig.
- Ta yngelen (se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale) ut av thermobox og sette dem i Petriskål. Bruke en sprøyting flasken og sil, sile gjennom vaksen fjerne detritus.
- Angi mikroskop og kameraet (se supplerende fil 1: S.5. Mikroskop og phototechnics).
- Sette yngel bur (eksperimentell laboratoriearbeid)
- Plass sandstranden buret i boksen plast. Scatter sorterte sand (se trinn 2.1.3) opp til en tredjedel av høyden på sandstranden buret. Hell vann i boksen. Kontroller at sand overflaten er ca 10 mm under vannstanden. Sett inn sandstranden buret i boksen 25 L i elva vann og utsette det til samme temperatur som de unge FWPMs (se supplerende fil 1: S.6.2. Lagring av biologisk materiale) 12 h. unngå noen eksponering av sand for sollys.
- Ta Petriskål med forberedt FWPM yngelen.
- Sjekk individets fitness ved ser inn i okularet (se trinn 1.5.2).
- Utføre fotografisk dokumentasjon som følger. Ta et bilde av alle individer oppdaget (se trinn 1.5.3) og velg 10 største personer. Alternativt ta bilder av alle yngel med lav forstørrelse (~ 40 X) for en bulk evaluering og velge de 10 største personene. Lagre alle bildene og registrere sine tall.
- Bruker en sprøyting flasken, flytte FWPM yngelen til forberedt sandstranden buret.
- Store yngel
- Sett byrået inn på store plast boksen med elvevann slik at buret er helt oppslukt og holde det i thermobox. La yngelen tilpasse seg i situ elva temperaturen (gradvis kjøling, maks 5 ° C for 24 h) før installasjonen.
- Installere sandstranden burene
- Forberede materialet for feltet installasjon: sandstranden bur, en ~ 25-L feltet thermobox, en flat stein (minimal vekt 1 kg), en netto (mesh størrelsen 10 x 10 mm), en sprøyting flasken, feltet temperatur dataloggers (se Tabell for materiale og supplerende fil 1: S.4.2. vann måling), en spade og feltet protokollen.
- Transport av merdene med yngelen til området i feltet thermobox, holde en stabil vanntemperaturen (~ 2 ° C endre). Sette feltet thermobox med sandstrand merdene i elva på webområdet feltet la FWPM yngelen tilpasse seg miljøforholdene (pH, ledningsevne, osv.).
- Installere sandstranden merdene i habitater med typisk for FWPMs (f.eksved hovedstrøm flyten i en slynger seg, ikke i direkte vannstrømmen, ikke i stående vann, ikke i direkte sollys).
- For åpent vann, fest sandstranden merdene til en flat stein med en netto og plassere den på elven bunnen. Kontroller at større siden av buret danner en vinkel på 45° med strømmen.
- For Hyporheal, grave merdene i elven bunnen vinkelrett vannstrømmen slik at buret lokket er level med at elven undersiden.
Merk: Det anbefales å utføre regelmessige kontroller og vedlikehold innfesting (se supplerende fil 1: S. 4. 1. nettstedet sjekker).
- Avinstallere burene og transport yngel etter eksponering
Merk: se supplerende fil 1: S.3. Eksponering varigheten.- Trekk merdene ut av vannet, fjerne dem drev materiale og sette dem inn i feltet thermobox fylt med elvevann.
- Transportere merdene til laboratoriet og starte dødelighet og vekst rate evalueringen.
Merk: Ved en temperaturforskjell på mer enn 5 ° C mellom merdene og laboratoriemiljø er det nødvendig å la temperaturene utjevne.
- Separat FWPM yngel fra sand
- Forberede en runde container med 50 mm dyp (for hver bur separat) og en ekstra runde beholder. Overføre sand fra buret til beholderen runde. Bruk en virvlende bevegelse bleke lettere partiklene i en ekstra beholder.
- Smak innholdet fra denne beholderen gradvis og etter yngel trinnvise bruker en Pasteur pipette og et forstørrelsesglass. Sette yngelen i Petriskål bruker Pasteur pipette. Gjenta dette trinnet til siste ungdoms har blitt funnet og en 10 x etter første negativt funn. Etter hver vask trinn Legg ren elvevann til original emballasjen med sand.
Merk: Etter den første vaske, skal undersøke innholdet og rengjør det av ballast som fine sedimenter og andre alluvia.
- Evaluere eksperimentet
- Sjekk egnethet av hver yngel (se trinn 2.4.3 og 1.5.2) og telle antall overlevende.
- Ta et bilde (se trinn 2.4.4.) til hver enkelt separat, selv om dette betyr at det er ingen klar identitet til hver enkelt. Alternativt ta bulk bilder og velge et delsett av de 10 mest dyrket personene fra de endelige resultatene.
Merk: Begge mulighetene har lignende rapportering verdien. Situasjon 1 har en begrensning av en høyere arbeidsbelastning, men også den høyeste bilde forstørrelse og dermed også større nøyaktighet.
- Fullføre eksperimentet
- Utføre målinger i analyseprogramvare. Fullføre eksperimentet som gjort i mesh merdene (se trinn 1,10) med følgende unntak: vurderer ikke veksten (%) av hver juvenil men vurdere gruppen som helhet i sandstranden bur eksperimentet.
Merk: Etter eksperimentet-overlevende, skal returneres til avlsprogrammet
(se supplerende filen S.6.1. Selection av et biologisk materiale).
- Utføre målinger i analyseprogramvare. Fullføre eksperimentet som gjort i mesh merdene (se trinn 1,10) med følgende unntak: vurderer ikke veksten (%) av hver juvenil men vurdere gruppen som helhet i sandstranden bur eksperimentet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De fire bioindication metodene (åpent vann sandstranden bur, sandstrand bur i seng, åpne vann mesh bur og mesh bur i seng) ble brukt til å etterforske miljøet tilstand egnetheten for FWPMs i øvre Vltava vassdraget (Böhmerwald, Tsjekkia Republikken). Denne elven representerer én FWPM gjenværende lokaliteten i sentrale Europa19. Her presenterer vi et spesielt utvalgte sett med resultater illustrerer de viktigste aspektene av fire metoder. Ytterligere detaljer er beskrevet i en omfattende studie av Černá et al. 13.
Elven miljøet ble studert på to nivåer:
(I) en langsgående elven profil var representert ved hovedstrøm lokaliteter (nettsteder A - E) og sideelver til forskjellige forurensning etapper (nettsteder R og V). Lokalitetene ble testet etter sandstranden bur og mesh cages installert i fri flyt vann. I tillegg en grus hyporheic sone ble testet i sengen sandy bur i lokaliteter B, C og D.
(II) en hyporheic miljø ble testet i valgte lokaliteten C. Hensiktsmessigheten av ulike underlag (sand, grus, steiner) ble testet innenfor-sengs mesh burene.
Den vekst og overlevelse av > 1 år gamle barn (se supplerende fil 1: S.6. Biologisk materiale) ble testet. Eksperimentet ble gjennomført i sin grad sommeren 2014 og ble gjentatt i mindre omfang på noen steder sommeren 2015. I nivå (I), 2-6 sandy bur med minst 100 yngel og 6 (2014) eller 4 (2015) mesh bur med 6 yngel ble brukt på hver lokalitet testet av denne metoden. I nivå (II), ble 7 mesh bur med 6 yngel installert i alle testede miljø. Eksponeringstid var måned for mesh merdene og tre måneder for sandstranden merdene.
Den statistiske analysen ble gjennomført i R, versjon 3.1.020. Kruskal-Wallis, Kruskal-Nemenyi og Diversified-Mann-Whitney tester ble brukt. Data med en normalfordeling, ble lineær eller kvadratiske regresjon utført.
Lokalitetene kan skilles klart basert på veksten i åpent vann mesh merdene tross den høye i buret variasjonen, selv i ulike vekst-gunstige perioder (Figur 3). Vekst-gunstigere eksponering i 2015 (vekst rate 19.3-41.8%), ble en betydelig trend oppdaget i langsgående profilen der veksten økt nedstrøms (Kruskal-Wallis test, p < 0,001). Viktigere, var overlevelse ekvivalent høy i begge sesonger (fra 83%) (Figur 4A).
På den annen side, åpent vann sandstranden merdene viste en annen trend mellom hovedstrøm lokalitetene i 2014: veksten økt nedstrøms fra lokalitet (52%) gjennom midten området C (153%), og deretter reduseres igjen til lokalitet E (46%) (en kvadratisk regresjon absolutt vekst verdier: r2adj = 0,77, F2,13 = 25.66, d.f. = 16, p < 0,001). Denne trenden ble også bekreftet i 2015 når største veksten ble innspilt i midten lokaliteten C igjen. Også, de absolutte vekst verdiene ikke avvike mye mellom 2014 og 2015. På den annen side, forskjellig overlevelse mellom år, blir mye høyere i 2015 (fra 48% til 72%) enn i 2014 (ca 25%) (Figur 4B).
En effekt av ulik eksponering metodene er også tydelig i den forurensede sideelven (lokalitet V). Sandstranden merdene utsatt her i løpet av tre måneder viste 0% overlevelse, mens en 83% overlevelse med noen vekst ble spilt av åpent vann mesh burene eksponering her i løpet av 30 dager.
Resultater fra i-sengen sandstranden burene illustrere ulike forhold i hyporheic miljøet i forhold til åpent vann på de aktuelle stedene. Veksten var alltid lavere i hyporheal områder enn i åpent vann, og overlevelse var mye mer variabel (fra nesten 50% til 0%, figur 4B).
En studie av hyporheic microhabitats med innen-sengs mesh merdene viste en signifikant effekt av underlaget sammensetningen på juvenile overlevelse. De beste forholdene ble registrert fra oksygen-mettet steinete bunnen (en overlevelse nær 100%) mens verste (en < 40% overlevelse) ble angitt i dårlig oksygenrikt sand der en svært høy variasjon i overlevende ble også oppdaget. Hyporheic vann oksygenering, som gjentatte ganger ble målt under eksperimentet, forklarer denne trenden (figur 5).
Figur 1. Bioindication maske bur med enkelte kammer. Se utfyllende fil 1 for ytterligere detaljer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Bioindication sandstrand buret. Se utfyllende fil 1 for ytterligere detaljer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Individuell variasjon i juvenile vekstrate registrert av åpent vann mesh bur i lokaliteter B og E i to sesonger. Midler og standardavviket er beskrevet for hver mesh bur. Verdiene er basert på måling av 6 yngel (eller 4-5 yngel hvis dødeligheten > 0%) i alle mesh bur.
Figur 4. Eksempel resultater fra en feltet bioindication eksperimentere med mesh og sandy burene. (A) dette panelet viser eksempel resultater fra et felt bioindication eksperiment med mesh bur. Totalt 6 lokaliteter (B, C, D, E, R og V) i Moldau nedbørsfeltet ble testet på 2 separate anledninger (i 2014 og 2015). Eksponeringstid var 30 dager i sommersesongen. Lokalitetene B - E representerer (i rekkefølge) en langsgående profil av en ca 20 kilometer strekning av elva hovedstrøm. Lokaliteter R og V representerer profiler av 2 sideelver. Hovedsteder merke samme sted både i panelet (A) og (B). Alle steder ble testet med åpent vann mesh bur. I tillegg lokalitet C ble også testet med innen-sengs mesh cages installert i 3 forskjellige typer elveleiet (Cs = sand, Cg = grus, Cst = steiner) i 2014. Merdene ble installert i 4-7 gjennomkjøringer på hvert område. 6 ferskvann perle blåskjell yngel av 1 + år gammel ble brukt per mesh bur. Gjennomsnittlige veksten er merket for de 3 største personene (maks. 3) fra hver testet mesh bur (kolonner, venstre akse) og gjennomsnittlig overlevelse per mesh bur (blå poeng, høyre akse). (B) dette panelet viser eksemplet resultater fra en feltet bioindication eksperimentere med sandstrand burene. En total of7 steder (A, B, C, D, E, R og V) i Moldau nedbørsfeltet ble testet på 2 separate anledninger (i 2014 og 2015). Eksponeringstid var 3 måneder i sommersesongen. Nettsteder A - E representerer (i rekkefølge) en langsgående profil av en ca 30 km lang strekning av elva hovedstrøm. R og V representerer profiler av 2 sideelver. Hovedsteder merke samme sted både i denne og i tidligere panelet. Alle steder ble testet med åpent vann sandstranden bur. I tillegg lokaliteter B, C og D ble også testet med innen-seng sandstranden cages installert i gavel elva sengen substrat (Bg, Cg og Dg) i 2014. Merdene ble installert i 2-4 gjennomkjøringer på hvert område. Minst 100 ferskvann perle blåskjell yngel var tilstede i hver sandstranden bur. Gjennomsnittlig vekstrate for 10 største personer (maks. 10) fra hver testet sandstranden bur (kolonner, venstre akse) og gjennomsnittlig overlevelse per sandstranden bur (blå poeng, høyre akse) merkes. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. Oksygenmetning. Dette panelet viser forholdet mellom minimal verdier av oksygenmetning over 30 dager mesh burene eksponering og overlevende prisen per bur innen-sengs mesh burene eksponert i forskjellige bed microhabitats i 2014. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| 2014 | 2015 | |||
| lokalitet | 3 måneders eksponering av sand burene | 1-måned eksponering av mesh burene | 3 måneders eksponering av sand burene | 1-måned eksponering av mesh burene |
| A | 13,9 | - | - | - |
| B | 14.4 | 13.4 | 13,9 | 17,5 |
| C | 15 | 13.8 | 14.4 | 18.3 |
| D | 15 | 13.8 | 14.3 | 18.3 |
| E | 15.5 | 14 | - | 18,7 |
| R | 13.5 | 12,8 | - | - |
| V | 14 | 13.2 | - | - |
Tabell 1. Gjennomsnittlig overflatevann temperaturen (° C) lokalitetene under eksponering i 2014 og 2015.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eksponeringstid:
Selv én måned utsatt mesh burene Vis en synlig vekst gjenspeiler forskjeller mellom steder (Figur 3), så de er veldig brukbare for rask og enkel påvisning av lokaliteten karakteristikk. Likevel relevansen av resultatene, avhenger av kortsiktige staten betingelsene, som kan svinge. Spesielt kan kort nedbør hendelser spille en rolle. Derimot kan uforutsigbare episodisk forurensning ikke alltid spilles. I lokaliteten V (figur 4A) oppdaget vann kjemi analyse en kortbølge sterk ammonium økning13. Dette var sannsynligvis ansvarlig for dødeligheten i tre måneders eksponerte sandstrender merdene men påvirke ikke 30 dager utsatte mesh merdene.
Temperatur kursbevgelsene kan også påvirke kortsiktige eksponering resultater. Én måned gjennomsnittlig temperatur om mesh bur eksponering er forskjellig mellom år (tabell 1). Veksten varierer også hvor temperaturer var ledsaget av høyere vekstrater (Kruskal-Wallis test p < 0,001). På den annen side, gjennomsnittlige temperaturen på de samme lokalitetene i løpet av tre måneders sandstranden bur eksponering var svært lik i begge år (tabell 1) og veksten ikke avvike betydelig (figur 4B).
Fordeler og svakheter av metodene beskrevet:
Et åpent vann eksponering er relativt enkel å utføre, men er av begrenset verdi for habitat bioindication. Åpent vann mesh burene er relativt gamle16 og har brukt gjentatte ganger med mindre endringer10,11,12,13,21,22 , 23. imidlertid disse burene er ikke begrenset av oksygen, som mangel er sannsynligvis ansvarlig for mange juvenile dødsfall i hyporheic forhold. Dermed åpent vann mesh bur kan vise god utvikling i lokaliteter med økt dødelighet og en avtagende vekst i åpent vann sandstranden bur (lokalitet E) eller en 100% dødsrate i i-sengen sandstranden bur, som i lokaliteten D i 2014 (figur 4B). Angivelig, åpent vann mesh merdene viser lokalitet vekst potensial, men dette kan ikke være realistisk som det er avhengig av ekte tilgjengeligheten av hyporheic microhabitats i en lokalitet. Fordi åpent vann mesh merdene har muligheten for høy overlevelse (figur 4A), selv opp til en 100% overlevelse rate13, kan de fungere godt for bioindication av kronisk toksisitet (eller Akutt toksisitet hvis det forventes på et gitt tidspunkt). De kan også være en nyttig mat kilde tilstedeværelse testing til en viss grad.
Som ny og uvanlig simulere åpent vann sandstranden merdene bedre hyporheic habitat forhold. Bevegelse av yngel mellom sandkornene er mulig i apparatet, som bidrar til å redusere biofilm veksten på juvenile shell. En hyporheic oksygenmangel kan skyldes aktiviteten av mikrober kolonisere sandkornene; Denne effekten kan også delvis oppstå inne burene plassert over en elv-bunn. Likevel grunn nødvendig periodiske rengjøring av tilstopping drivende materiale fra en bur, fine sedimenter er også fjernet og dermed forholdene endres i forhold til det naturlige hyporheic habitatet. Så, veksten kan også betraktes som lokalitet vekst potensial i åpent vann sandstranden bur. Dette er imidlertid nærmere ekte lokalitet egnethet enn i åpent vann mesh burene. Derfor synes langsgående veksten rate graderingene registrert av sand bur (figur 4B) også å være mer troverdig og angi en mer passende elven strekning. Videre i sandstranden bur er mulighet for barn og subadults avl opp til seksuell modenhet bekreftet9, så sandstrand bur kan tjene som en sikker metode for avl og biomonitoring samtidig.
Sandy bur og mesh bur plassert i i-sengs posisjon er nærmest den virkelige forholdene i et grunt hyporheal. Ved at en juvenil bevegelse, sandstrand bur, spesielt tilby dem både loddrett og vannrett gradering av flere centimeter i skala. Denne evnen til å flytte kan være svært viktig for å unnslippe fra midlertidig oksygen-mangelfull mikro-soner. Denne muligheten er fraværende i i-sengen mesh burene. Derfor er et relativt høyt antall bioindication enheter nødvendig fordi de hyporheic betingelsene er svært variabel13,24 (figur 5) og grunn en upassende plassering er vanlig.
I sammendraget samsvarer bioindication metoder brukt i denne forskningen med antatt juvenile naturgitte forhold i følgende rekkefølge:
1. Åpne vann mesh bur,
2. Åpne vann sandstranden bur,
3. i-sengs mesh bur,
4. i-seng sandstranden burene.
Arbeidsmengden per enhet øker i samme rekkefølge. Videre oppnådd juvenile nummeret kreves for en statistisk testing av resultatene økning i innenfor-sengs eksponeringer for. Det virker som i seng sandstranden burene representerer en dyrere men nøyaktig bioindication metoden. Denne nye metoden trenger mer testing i fremtiden og sammenligning med andre typer hyporheic studier basert på piezometer målinger25,26. Spesielt er det behov for å studere sammenfall med en direkte sonde måle mekanisk-forhold i merdene og hyporheic omgivelsene.
Antall personer målt i en bur:
Sammenlignet med mesh bur, er det ikke mulig å måle økningen av bestemte yngel i sandstranden bur som det er ingen informasjon på hvilket individ fra input settet er som i utdataene. Det er nødvendig å arbeide med en gjennomsnittsverdi. Hvis telt for alle individer, kan denne verdien være svært lav grunnet en rekke svært langsomt voksende prøver; men et par personer kan vokse raskt (vekst jumpers). Slik ujevn vekst er typisk for blåskjell27. Vekst variasjon blant yngel stiger med økende eksponeringstid og store forskjeller kan oppstå, spesielt i vekst-gunstige sesonger. Også lang eksponering fører til større dødelighet i mesh merdene (for en gjennomgang se Lavictoire, Moorkens, Ramsey, Sinclair og Sweeting28), så vi kan jobbe med et betydelig lavere antall individer ved slutten av forsøket sammenlignet den Angi yngel sett. Måler bare flere best voksende vaksen er en mulig metode.
Opplevelsen av FWPM avl i tsjekkiske handlingsplanen for ferskvann Pearl blåskjell9,29, samt resultatene fra eksperimentene på havet annet muslinger30,31, antyder at vekst-mangelfull juvenil annet muslinger har en høy dødelighet, og det er bare ubetydelig sjanse for lever til forfall. Derimot vekst jumpers har en høyere overlevelse og de er avgjørende for en befolkningen utvinning. Parameteren 10 MAX (10 mest raskt voksende personer) tar vekst jumpers og kan øke informativ verdien av eksperimentet, selv om høy dødelighet skjer (figur 4B, sesongen 2014). Det bør bemerkes at veksten estimatet ved denne metoden ikke kan være en falsk positiv. Det kan bare være litt undervurdert fordi mange av de største yngel på slutten av eksperimentet ville ha vokst litt mer i dette tilfellet. Også er arbeidsmengden mindre hvis bare 10 individer evalueres. Tilsvarende en måling av tre maksimalt voksende personer (maks. 3) viste seg for å være riktig i mesh bur, eliminere påvirkning av langsomt voksende, ikke-perspektiv enkeltpersoner, som kunne lede bildet av nettstedet vekstpotensial.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Michal Bílý og Ondřej P. Simon ble støttet av tilskudd fra den tsjekkiske UMB [interne Grant byrå av fakultet miljø, CULS Praha (42110 1312 3175 (20164236))]. Støtte for Karel Douda kom fra tsjekkiske Science Foundation (13-05872S). Data på bioindication og nåværende forekomsten av perle blåskjell ble samlet inn i gjennomføringen av tsjekkiske handlingsplanen for ferskvann Pearl blåskjell administrert av naturen bevaring byrået i Tsjekkia, som er finansiert av regjeringen i den Tsjekkia og er tilgjengelig på
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| biological material maintenance and care | |||
| Freshwater pearl mussel juveniles | any | NA | from a FWPM breeding programme |
| plastic boxes | any | NA | |
| thermobox | MERCI | 212,070,600,030 | There are many possibilities. This is one example only. |
| field thermobox (ca25 l) | any | NA | cold box (insulated box) commonly used for food transport |
| river water | any | NA | |
| Petri dishes | any | NA | |
| plastic Pasteur pipettes with balloon bulb (droppers) | any | NA | hole diameter 1 mm |
| hydrogen peroxide | any | NA | |
| plastic container (ca 50 l) for river water | any | NA | |
| plastic tea strainer | any | NA | commonly used in kitchen |
| mesh cages construction | |||
| main plastic bodies | any | NA | |
| plactic covers | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| special technical sieves 100 µm | Silk &Progress | UHELON 67 M | |
| rubber hose (diameter 5.5 mm) | any | NA | |
| steel bolts | any | NA | |
| steel nuts | any | NA | |
| spanner | any | NA | |
| steel spikes | any | NA | |
| pliers | any | NA | |
| beakers | any | NA | |
| plastic dishes (ca. 25x15x3-5cm) | any | NA | |
| squirt bottle | any | NA | |
| field protocols | any | NA | |
| stationery | any | NA | |
| plastic container | any | NA | |
| string | any | NA | |
| hammer | any | NA | |
| sandy cages construction and use | |||
| sieve 1 mm | any | NA | |
| sieve 2 mm | any | NA | |
| special technical sieves 340 µm | Silk &Progress | UHELON 20 T | |
| plastic boxes with tight-fitting lid | any | NA | |
| hot melt adhesive | any | NA | |
| plastic box (ca 250 x 150 x 100 cm) | |||
| big plastic box (ca 25 l) | any | NA | |
| flat stone | any | NA | |
| net | any | NA | |
| river sand | any | NA | |
| round containers | any | NA | |
| magnifying glasses | Carson | Carson CP 60 | There ar many possibilities. This is one example only |
| cages installation and maintenance | |||
| field temperature dataloggers | ONSET | UA-001-64 | http://www.onsetcomp.com/products/data-loggers/ua-001-64 |
| spade | any | NA | |
| toothbrush | any | NA | |
| experiment evaluation | |||
| trinocular dissecting zoom stereo microscope | Bresser optic | ICD 10x-160x | There are many possibilities. This is one example only. |
| digital camera/ electronic eyepiece | Bresser optic | MikroCamLab 5M | There are many possibilities. This is one example only. |
| Calibration gird | Am Scope | SKU: MR100 | There are many possibilities. This is one example only. |
| external power source with two movable light guides | Arsenal | K1309010150021 | There are many possibilities. This is one example only. |
| Image software | ImageJ software | There are many possibilities. This is one example only. | |
| table processor | MS excel | There are many possibilities. This is one example only. |
References
- Goldberg, E. D. The mussel watch-a first step in global marine monitoring. Marine Pollution Bulletin. 6 (7), 111-114 (1975).
- Vaughn, C. C. Ecosystem services provided by freshwater mussels. Hydrobiologia. , In Press (2017).
- Lopes-Lima, M., et al. Conservation status of freshwater mussels in Europe: state of the art and future challenges. Biological Reviews. 92 (1), 572-607 (2017).
- Strayer, D. L., Malcom, H. M. Causes of recruitment failure in freshwater mussel populations in southeastern New York. Ecological Applications. 22 (6), 1780-1790 (2012).
- Douda, K. Effects of nitrate nitrogen pollution on Central European unionid bivalves revealed by distributional data and acute toxicity testing. Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 20 (2), 189-197 (2010).
- Modesto, V., et al. Fish and mussels: importance of fish for freshwater mussel conservation. Fish and Fisheries. , In Press (2017).
- Ecology and evolution of the freshwater mussels Unionoida. Bauer, G., Wächtler, K. 145, Ecological Studies. 1-394 (2001).
- Neves, R. J., Widlak, J. C. Habitat ecology of juvenile fresh-water mussels (Bivalvia, Unionidae) in a headwater stream in Virginia. American Malacological Bulletin. 5, 1-7 (1987).
- Švanyga, J., Simon, O. P., Mináriková, T., Spisar, O., Bílý, M. Záchranný program pro perlorodku říční v ČR (Action plan for the endangered freshwater pearl mussel in the Czech Republic). , NCA CR. Prague, Czech Republic. (2013).
- Schmidt, C., Vandré, R. Ten years of experience in the rearing of young freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 20 (7), 735-747 (2010).
- Gum, B., Lange, M., Geist, J. A critical reflection on the success of rearing and culturing juvenile freshwater mussels with a focus on the endangered freshwater pearl mussel (Margaritifera margaritifera L.). Aquatic Conservation: Marine and Freshwater Ecosystems. 21 (7), 743-751 (2011).
- Denic, M., Taeubert, J. E., Lange, M., Thielen, F., Scheder, C., Gumpinger, C., Geist, J. Influence of stock origin and environmental conditions on the survival and growth of juvenile freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera) in a cross-exposure experiment. Limnologica. 50, 67-74 (2015).
- Černá, M., Simon, O. P., Bílý, M., Douda, K., Dort, B., Galová, M., Volfová, M. Within-river variation in growth and survival of juvenile freshwater pearl mussels assessed by in situ exposure methods. Hydrobiologia. , In Press (2017).
- Denic, M., Taeubert, J. E. Trophic relationships between the larvae of two freshwater mussels and their fish hosts. Invertebrate Biology. 134 (2), 129-135 (2015).
- Douda, K. Host-dependent vitality of juvenile freshwater mussels: implications for breeding programs and host evaluation. Aquaculture. 445, 5-10 (2015).
- Buddensiek, V. The culture of juvenile freshwater pearl mussels Margaritifera margaritifera L. in cages: a contribution to conservation programmes and the knowledge of habitat requirements. Biological Conservation. 74 (1), 33-40 (1995).
- Hruška, J. Experience of semi-natural breeding program of freshwater pearl mussel in the Czech Republic. Die Flussperlmuschel in Europa: Bestandssituation und Schutzmaßnahmen. , Albert-Ludwigs Universität: Freiburg. Kongressband. WWA Hof 69-75 (2001).
- Barnhart, M. C. Buckets of muckets: a compact system for rearing juvenile freshwater mussels. Aquaculture. 254 (1), 227-233 (2006).
- Simon, O. P., Vaníčková, I., Bílý, M., Douda, K., Patzenhauerová, H., Hruška, J., Peltánová, A. The status of freshwater pearl mussel in the Czech Republic: several successfully rejuvenated populations but the absence of natural reproduction. Limnologica. 50, 11-20 (2015).
- R Core Team. A language and environment for statistical computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. Available from: https://www.r-project.org/ (2013).
- Hastie, L. C., Yang, M. R. Conservation of the freshwater pearl mussel I: captive breeding techniques. 2, Natural England. Peterborough, UK. Conserving Natura 2000 Rivers Conservation Techniques Series No. 2 (2003).
- Hruška, J. Nahrungsansprüche der Flußperlmuschel und deren halbnatürliche Aufzucht in der Tschechischen Republik. Heldia. 4 (6), 69-79 (1999).
- Scheder, C., Lerchegger, B., Jung, M., Csar, D., Gumpinger, C. Practical experience in the rearing of freshwater pearl mussels (Margaritifera margaritifera): advantages of a work-saving infection approach, survival, and growth of early life stages. Hydrobiologia. 735 (1), 203-212 (2014).
- Braun, A., Auerswald, K., Geist, J. Drivers and spatio-temporal extent of hyporheic patch variation: implications for sampling. PLoS ONE. 7 (7), e42046 (2012).
- Franken, R. J. M., Storey, R. G., Williams, D. D. Biological, chemical and physical characteristics of downwelling and upwelling zones in the hyporheic zone of a north-temperate stream. Hydrobiologia. , 183-195 (2001).
- Roley, S. S., Tank, J. L. Pore water physicochemical constraints on the endangered clubshell mussel (Pleurobema clava). Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 73 (12), 1712-1722 (2016).
- Larson, J. H., Eckert, N. L., Bartsch, M. R. Intrinsic variability in shell and soft tissue growth of the freshwater mussel Lampsilis siliquoidea. PLoS ONE. 9 (11), e112252 (2014).
- Lavictoire, L., Moorkens, E., Ramsey, A. D., Sinclair, W., Sweeting, R. A. Effects of substrate size and cleaning regime on growth and survival of captive-bred juvenile freshwater pearl mussels, Margaritifera (Linnaeus, 1758). Hydrobiologia. 766 (1), 89-102 (2015).
- Hruška, J. Experience of semi-natural breeding programme of freshwater pearl mussel in the Czech Republic. Die Flussperlmuschel in Europa: Bestandssituation und Schutzmassnahmen. , 69-75 (2000).
- Bayne, B. L. Physiological components of growth differences between individual oysters (Crassostrea gigas) and a comparison with Saccostrea commercialis. Physiological and Biochemical Zoology. 72 (6), 705-713 (1999).
- Tamayo, D., Azpeitia, K., Markaide, P., Navarro, E., Ibarrola, I. Food regime modulates physiological processes underlying size differentiation in juvenile intertidal mussels Mytilus galloprovincialis. Marine Biology. 163 (6), (2016).
