الجمعية وتنقية من النموذج إينتاسوميس فيروس مزبد
Summary
Integrase الفيروسات التراجعية المؤتلف والحمض النووي ليغومرات محاكاة نهايات الحمض النووي الفيروسي يمكن أن تشكل مجمع نشطة انزيماتيكالي المعروف باسم إينتاسومي. ويمكن استخدام إينتاسوميس للدراسات الكيميائية الحيوية والهيكلية، والحركية. هذا البروتوكول تفاصيل كيفية تجميع وتنقية إينتاسوميس فيروس مزبد النموذج.
Abstract
أ تحديد الميزة وخطوة ضرورية لدورة حياة لفي هو دمج الجينوم الفيروسي في جينوم مضيف. ترميز كافة الفيروسات القهقرية إنزيم integrase (في) الذي يحفز التساهمية ضم الفيروسية للمضيف الحمض النووي، والذي يعرف باسم نقل حبلا. الاندماج قد يكون على غرار في المختبر مع المؤتلف في النسخ العكسي والحمض النووي ليغومرات محاكاة نهايات الجينوم الفيروسي. كي الخص رد فعل الاندماج التي تحدث في فيفو، تكامل أوثق مجمعات يتم تجميعها في المؤتلف وليغومرات الاصطناعية بالغسيل الكلوي في المخزن مؤقت انخفاض تركيز ملح. يمكن تنقية التكامل المعقدة، ودعا إينتاسومي، بحجم الاستبعاد اللوني. في حالة نموذج مزبد الفيروس (فف)، إينتاسومي تيترامير في وهما الحمض النووي ليغومرات وسهولة يفصل في موحودي والحرة أوليجومير الحمض النووي. قد جزيئي كفاءة التكامل إينتاسوميس فف تحت مجموعة متنوعة من الظروف التجريبية فهم أفضل لديناميات وآليات التكامل للفيروسات الرجعية.
Introduction
يتم دمج الجينوم الفيروسي في جينوم مضيف خطوة إلزامية في دورة الحياة لجميع الفيروسات القهقرية1. إينتيجراسي الإنزيم الفيروسي (في) يحفز التساهمية ضم كل نهاية لجينوم الحمض النووي الفيروسي إلى المضيف الحمض النووي. أثناء عدوى خلوية، في هو جزء من مجمع ما قبل الاندماج الذي يتوسط التكامل. في المؤتلف الرصاصية مع مزدوجة ليغومرات الحمض النووي الذين تقطعت بهم السبل محاكاة نهايات الحمض النووي الفيروسي يمكن أيضا تنفيذ الاندماج في الحمض النووي المستهدف في المختبر2. مشتركة تكامل فحص في المختبر يستخدم بلازميد سوبيركويليد كهدف الحمض النووي. التكامل بين كلا ليغومرات الحمض النووي الفيروسي (فدنا) بلازميد ينتج منتج خطي ويطلق على تكامل منسقة (الشكل 2A). إدماج التحليل في المختبر قد أيضا تعطي المنتجات مع واحد فقط فدنا تساهمي انضم إلى بلازميد المستهدفة الناتجة في دائرة استرخاء. يبدو أن هذا المنتج التكامل النصف-الموقع الحرفية للفحص في المختبر.
قد تؤدي في المؤتلف وفدنا التكامل في المختبر، لكنها ليست الكواشف مثالية لدراسة ديناميات أو هيكل المجمعات التكامل عند أحادي في أن يحجب المرئيات ذات الصلة. التكامل المنقي المجمعات، أو “إينتاسوميس”، مطلوبة من أجل دراسات تحليل أو هيكلية ديناميكية جزيء واحد. في فف وفدناس قد يتم تجميعها بالغسيل الكلوي من المخزن مؤقت تركيز ملح مرتفعة نسبيا إلى انخفاض تركيز ملح3،4. أثناء الغسيل الكلوي، متسرعا أشكال. تتم إزالة هذا متسرعا من الغسيل الكلوي وزيادة تركيز الملح. تركيز الملح العالي سولوبيليزيس إينتاسوميس فف تتضمن متعجل. ثم يتم تنقيته في إينتاسوميس بحجم الاستبعاد اللوني (ثانية). قد ثبت أولى المؤتلف فيروس مزبد (بفف) في الوجود مونومر في الحل بتركيزات تصل إلى 225 ميكرومتر5. تجزئة ثانية فعلياً يفصل بين إينتاسوميس فف (كاتشين 225.5)، الذي يتضمن تيترامير في فف وهما فدناس، فف أحادي في (44.4 كاتشين) والحر فدنا (24.0 كاتشين). إينتاسوميس بفف قد تكون مجمدة، والاحتفاظ بنشاط إدماج لمدة ستة أشهر على الأقل من التخزين في ˚C-80.
يمكن تعديل المؤتلف فف إينتاسوميس أيضا أن تدرج في استبدال الأحماض الأمينية أو الطفرات الاقتطاع أو فدناس المسمى مع4،فلوروفوريس أو البيوتين6. سهولة أداء إينتاسوميس فف المنقي إدماج هدفا سوبيركويليد بلازميد الحمض النووي في المختبر. معظم فحوصات البيوكيميائية التكامل مع إينتاسوميس قد اختبار الآثار في الطفرات في مثبطات أو المضافات الكيميائية الأخرى. يمكن استخدام إينتاسوميس بيوتينيلاتيد لتحقيق تقارب مع الأحماض النووية أو البروتينات. إينتاسوميس فف وظيفية في درجة حرارة الغرفة، مما يسمح للتحليل المجهري جزيء واحد بملاقط مغناطيسية لقياس الوقت بين الانضمام إلى طرفي فدنا أو الأسفار الانعكاس الداخلي الكلي لتصور البحث إينتاسومي على الهدف 6من الحمض النووي. وباﻹضافة إلى ذلك، كانت إينتاسوميس بفف تتميز أول هيكلياً تؤثر إلى حد كبير مجال التكامل النسخ العكسي3.
Protocol
Representative Results
Discussion
وظائف النسخ العكسي تشكل مولتيميريك معقدة مع الحمض النووي الفيروسي لتنفيذ التكامل ومواصلة دورة الحياة الفيروسية. قد يكون العدد في مونومرات كل إينتاسومي تيتراميرس أو أوكتاميرس، أو ربما أعلى ترتيب مولتيميرس11،12،،من1314. إ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
أيد هذا العمل AI099854 المعاهد الوطنية للصحة، و AI126742 إلى المفتاح.
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
References
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
