Иммунофенотипирование ортотопическая Homograft (сингенных) из мышиных первичной КЗК аденокарциномы поджелудочной железы протоковой подачей Cytometry
Summary
Экспериментальная процедура на Иммунофенотипирование мышиных ортотопическая PDAC homografts направлена на профилирование иммуно микроокружения опухоли. Опухоли являются orthotopically, имплантируются через хирургии. Опухоли3 200 – 600 мм в размере были собраны и отделить подготовить одноклеточных суспензий, следуют мульти иммунных маркеров СУИМ анализ с использованием различных дневно обозначенного антитела.
Abstract
Homograft (сингенных) опухоли являются рабочая лошадка сегодняшних иммуно онкология (ввода/вывода) доклинических исследований. Микроокружения опухоли (ТМЕ), особенно его иммунной компонентов, имеет жизненно важное значение для прогнозирования и прогнозирования результатов лечения, особенно иммунотерапии. TME иммунной компоненты состоят из различных подмножеств проникновения опухоли иммунных клеток оценимый многоцветные СУИМ. Протока поджелудочной железы аденокарцинома (PDAC) — среди страшных malignances, не хватает хорошего лечения, таким образом срочных и неудовлетворенные медицинской необходимости. Одной из важных причин для его способности реагировать различные терапии (химио-, целенаправленных, ввода-вывода) был обильным TME, состоящий из фибробластов и лейкоциты, которые защищают клетки тумора от этих методов лечения. Orthotopically, имплантированных PDAC считается более точно отбить TME человека поджелудочной железой, чем обычные модели подкожной (SC).
Homograft опухоли (КЗК), пересадке мыши спонтанное PDAC, происходящих от генетически КЗК мышей (KРАНG12D / +/P53– / –/Pdx1–Cре) (КПК-ГЭММ). Главным образом тумор ткани разрезать на небольшие фрагменты (3~ 2 мм) и пересаженные подкожно (SC) сингенных получателям (C57BL/6, 7-9 недель). Homografts были затем хирургическим orthotopically пересадили на поджелудочной железы новых мышей C57BL/6, наряду с SC-имплантации, который достиг опухоли объемов 300 – 1000 мм3 17 дней. Только опухоли 400 – 600 мм3 были собирают в утвержденных вскрытие процедуры и очищены, чтобы удалить прилегающих тканей не опухоль. Они были отделены в протокол, с помощью диссоциатором ткани в сингл клеточных суспензий, следуют окрашивание с назначенными группами дневно обозначенного антитела для различных маркеров различных иммунных клеток (лимфоидной, миелоидной и НК, DCs). Окрашенные Образцы анализировались с использованием многоцветные СУИМ для определения количества иммунокомпетентных клеток различных линий, а также их относительная доля в опухоли. Иммунных профили ортотопическая опухоли были затем по сравнению с теми SC опухолей. Предварительные данные продемонстрировал значительно повышенные инфильтрирующие Тилс/ТАМС в опухоли поджелудочной железы, и выше B-клеточной инфильтрации в ортотопическая, вместо того, чтобы SC опухоли.
Introduction
Протока поджелудочной железы аденокарцинома (PDAC) вызывает почти половины миллиона смертность всемирно ежегодно, один из убийц рака Топ 5. Существует несколько вариантов эффективного лечения и не утвержденных immunotherapies; Таким образом отчаянно необходимы новые методы лечения. Раковые заболевания получают все большее признание как иммунологических заболеваний, включая PDAC, помимо генетических заболеваний, как известно сегодня. Иммунологические и генетические факторы скорее всего будет определять прогноза заболевания, а также лечения результаты. Опухоли уклониться от принимающей иммунной наблюдения и в конечном итоге заранее вызвать смерть. Многие из этих иммунных процессов происходят в микроокружения опухоли (ТМЕ)1,2,3,4 , где различные типы иммунных клеток взаимодействуют с опухолевых клеток, друг с другом и с другими опухоли Стромальные компоненты, прямо или косвенно через цитокины, которые в конечном итоге определяют исход заболевания. Таким образом характеристика опухоли иммунной компонентов TME, или иммунофенотипирования опухолевых, включая подтипов, нумерация и локализация различных линий иммунных клеток, имеет решающее значение для понимания противоопухолевый иммунитет. В случае PDAC, было предложено, что повышенные проникновения опухоли подавляющих макрофагов (TAM) и B-клетки привели к предотвращению Т-клеточная инфильтрация и/или активации и высокий уровень фиброза5,6.
Общий подход к расследованию иммунной TMEs экспериментально бы с помощью суррогатного опухоли доклинических животных моделей, главным образом соответствующие мыши опухоли модели7, особенно мышь сингенных (homograft) или генетически модифицированные мыши модели (ГЭММ) рака, на себя подобии человека опухоли и иммунитет8,9и мыши. В действительности понимается, что есть присущи различия между двумя видами10,11.
Пересаженные мыши опухоли имеют значительные оперативные преимущества перед спонтанные опухоли7, а именно развитие синхронизированные опухоли, в отличие от родителей ГЭММ спонтанные опухоли развития. Homografts спонтанные мышиных опухоли считаются первичной опухоли никогда не был манипулировать в пробиркеи зеркального отображения исходного мыши опухоли гисто- / молекулярной патологии7, а также возможных иммунной профилей. Часто эти мышиных homografts считаются «мыши версию пациента производные ксенотрасплантатов (PDXs)». Поэтому они скорее всего есть лучше переводимости чем обычные сингенных клеток линии производные мыши опухоли12. В частности многие homografts являются производными от конкретных ГЭММ, где конкретные болезни человека механизмы, например драйвер онкогенных мутаций, инженерии, и эти homografts, следовательно, должны иметь преимущества для их клиническое значение. В частности КЗК ГЭММ развивать мыши PDAC в течение 15 – 20 недель возраста, что морфологически резюмирует заболеваний человека с преимущественно хорошо умеренно продифференцированным железистой архитектуры и высокообогащенного стромы. Эта модель также резюмирует наиболее распространенных генетических особенностей человека PDAC, а именно крас, активизируя мутации и P53-из функция потерь, которые происходят в 90% и 75% человеческого PDAC, соответственно5,6.
Сайты о трансплантации также было предложено играть свою роль в модели переводимости. Конкретные окружающей среде ткани, например в соответствующей среде ортотопическая, может быть нишу для конкретной опухоли в прогресс, в отличие от единой подкожной (SC) средах для часто пересаженных опухоли. Он будет представлять особый интерес, если, и, какая разница существует между двумя сайтами трансплантации, с точки зрения иммунной микроокружения и значение для человека рак, например. в случае PDAC.
Одним из наиболее важных аспектов иммунной профилирования, или иммунофенотипирование, необходимо определить проникновения опухоли иммунные клетки различных линий, числа, относительная доля в опухоли, а также их активации государств и местах. Это включает в себя опухоли infiltratrating lymphoctyes (Тилс, как T – и B-), проникновения опухоли макрофагов (ТАМС), проникновения опухоли естественных клеток-киллеров (НКС) и опухоли резидентов дендритных клеток,3,13,14 , 15 , 16 , 17и внутриклеточных локализации некоторых ячеек18,19,20, и т.д. Флуоресценции активирован ячейку Сортировка (FACS) или потока цитометрии является технология обнаружения одной ячейки, которая обычно используется для определения конкретных параметров ячейки. Разноцветный поток цитометрии меры несколько маркеров на одну ячейку3,4,21 и является наиболее часто используемым методом для определения числа и относительная доля различных подмножеств иммунных клеток, включая те внутри опухоли.
В настоящем докладе описываются процедуры для профилирования проникновения опухоли клетки иммунной системы: 1) имплантация ортотопическая PDAC мыши опухоль homografts, наряду с SC имплантации; 2) опухоль ткани урожай и подготовка одной клетки через диссоциации опухоли; 3) потока cytometry анализ всех клеток, производный от опухоли в качестве базовых данных; 4) сравнение базовые характеристики обоих подходов трансплантации.
Protocol
Representative Results
Discussion
Хотя более легко проводятся исследования с использованием SC опухоли, имплантированных orthotopically опухолей модели может быть более актуальной для доклинических фармакологии исследования (особенно расследования операций ввода-вывода) для обеспечения расширенной переводимости. Этот док?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Авторы бы поблагодарить д-ра Джоди Барбо – для критического чтения и редактирования рукописи и благодарю Ральф Мануэль для проектирования произведения искусства. Авторы хотели бы также поблагодарить Корона Bioscience онкологии иммуно-онкология биомаркер команды и команды онкологии В естественных условиях , за их большие усилия технического.
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
References
- Chevrier, S., et al. An Immune Atlas of Clear Cell Renal Cell Carcinoma. Cell. 169 (4), 736-749 (2017).
- Wargo, J. A., Reddy, S. M., Reuben, A., Sharma, P. Monitoring immune responses in the tumor microenvironment. Curr. Opin. Immunol. 41, 23-31 (2016).
- Mosely, S. I., et al. Rational Selection of Syngeneic Preclinical Tumor Models for Immunotherapeutic Drug Discovery. Cancer Immunol. Res. 5 (1), 29-41 (2017).
- Rühle, P. F., Fietkau, R., Gaipl, U. S., Frey, B. Development of a Modular Assay for Detailed Immunophenotyping of Peripheral Human Whole Blood Samples by Multicolor Flow Cytometry. Int. J. Mol. Sci. 17 (8), e1316 (2016).
- Jiang, H., et al. Targeting focal adhesion kinase renders pancreatic cancers responsive to checkpoint immunotherapy. Nat. Med. 22 (8), 851-860 (2016).
- Gunderson, A. J., et al. Bruton Tyrosine Kinase-Dependent Immune Cell Cross-talk Drives Pancreas Cancer. Cancer Discov. 6 (3), 270-285 (2016).
- Li, Q. X., Feuer, G., Ouyang, X., An, X. Experimental animal modeling for immuno-oncology. Pharmacol. Ther. 17, 34-46 (2017).
- Takao, K., Miyakawa, T. Genomic responses in mouse models greatly mimic human inflammatory diseases. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 112 (4), 1167-1172 (2015).
- Payne, K. J., Crooks, G. M. Immune-cell lineage commitment: translation from mice to humans. Immunity. 26 (6), 674-677 (2007).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J. Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
- von Herrath, M. G., Nepom, G. T. Lost in translation: barriers to implementing clinical immunotherapeutics for autoimmunity. J. Exp. Med. 202 (9), 1159-1162 (2005).
- Talmadge, J. E., Singh, R. K., Fidler, I. J., Raz, A. Murine models to evaluate novel and conventional therapeutic strategies for cancer. Am. J. Pathol. 170 (3), 793-804 (2007).
- Erdag, G., et al. Immunotype and immunohistologic characteristics of tumor-infiltrating immune cells are associated with clinical outcome in metastatic melanoma. Cancer Res. 72 (5), 1070-1080 (2012).
- Gutiérrez-Garcia, G., et al. Gene-expression profiling and not immunophenotypic algorithms predicts prognosis in patients with diffuse large B-cell lymphoma treated with immunochemotherapy. Blood. 117 (18), 4836-4843 (2011).
- Paiva, B., et al. PD-L1/PD-1 presence in the tumor microenvironment and activity of PD-1 blockade in multiple myeloma. Leukemia. 29 (10), 2110-2113 (2015).
- Youn, J. I., Collazo, M., Shalova, I. N., Biswas, S. K., Gabrilovich, D. I. Characterization of the nature of granulocytic myeloid-derived suppressor cells in tumor-bearing mice. J. Leukoc. Biol. 91 (1), 167-181 (2012).
- Lavin, Y., et al. Innate Immune Landscape in Early Lung Adenocarcinoma by Paired Single-Cell Analyses. Cell. 169 (4), 750-765 (2017).
- Mahoney, K. M., et al. PD-L1 Antibodies to Its Cytoplasmic Domain Most Clearly Delineate Cell Membranes in Immunohistochemical Staining of Tumor Cells. Cancer Immunol. Res. 3 (12), 1308-1315 (2015).
- Yamaki, S., Yanagimoto, H., Tsuta, K., Ryota, H., Kon, M. PD-L1 expression in pancreatic ductal adenocarcinoma is a poor prognostic factor in patients with high CD8+ tumor-infiltrating lymphocytes: highly sensitive detection using phosphor-integrated dot staining. Int. J. Clin. Oncol. 22 (4), 726-733 (2017).
- Jiang, Y., et al. ImmunoScore Signature: A Prognostic and Predictive Tool in Gastric Cancer. Ann. Surg. , (2016).
- Ribas, A., et al. PD-1 Blockade Expands Intratumoral Memory T Cells. Cancer Immunol. Res. 4 (3), 194-203 (2016).
