Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie
Summary
Die Versuchsdurchführung auf die Immunphänotypisierung der murinen orthotopen PDAC Homografts bezweckt die Profilierung der Tumor Immuno-Mikroumgebung. Tumoren sind Orthotopically über Operation implantiert. Tumoren von 200 – 600 mm3 in der Größe wurden geerntet und distanzierte um einzellige Suspensionen, gefolgt von Multi-immun FACS Markeranalyse mit verschiedenen fluoreszent-markierten Antikörpern vorzubereiten.
Abstract
Homograft (Phänomen) Tumoren sind das “Arbeitspferd” der heutigen Immuno-Onkologie (e/a) präklinischen Forschung. Der Tumor Mikroumgebung (TME), besonders seine immun-Komponenten ist entscheidend für die Prognose und Vorhersage der Behandlungsergebnisse, insbesondere der Immuntherapie. TME immun-Komponenten bestehen aus verschiedenen Untergruppen von Tumor infiltriert Immunzellen bewertbar durch mehrfarbige FACS. Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) zählt zu den tödlichsten Malignances fehlen gute Behandlungsmöglichkeiten, so eine dringende und ungedeckten medizinischen Bedarf. Ein wichtiger Grund für seine nicht-Reaktion auf verschiedene Therapien (Chemo-, gezielte, I/O) wurde seine reichlich TME, bestehend aus Fibroblasten und Leukozyten, die Tumorzellen von den Therapien zu schützen. Orthotopically implantierten PDAC geglaubt wird, um mehr genau zurückzuerobern TME der menschlichen pankreaskarzinome als herkömmliche subkutaner (SC) Modelle.
Homograft Tumoren (KPC) sind Transplantationen von Maus spontane PDAC aus gentechnisch KPC-Mäuse (K-RasG12D / +/P53– / –/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Der primäre Tumor-Gewebe ist schneiden Sie in kleine Fragmente (~ 2 mm3) und subkutan transplantiert (SC) an das Phänomen Empfänger (C57BL/6, 7 – 9 Wochen alt). Die Homografts wurden dann chirurgisch Orthotopically verpflanzt auf die Bauchspeicheldrüse von neuen C57BL/6 Mäusen zusammen mit SC-Implantation, die Tumor-Volumen von 300-1.000 mm3 von 17 Tagen erreicht. Nur Tumoren von 400 – 600 mm3 wurden gemäß dem genehmigten Autopsie Verfahren geerntet und gereinigt, um die angrenzenden keinen Tumor-Gewebe zu entfernen. Sie wurden getrennt pro Protokoll mit einem Gewebe Dissociator in einzellige Suspensionen, gefolgt von Färbungen mit dafür vorgesehenen Platten von eindringmittel-markierten Antikörpern für verschiedene Marker von verschiedenen Immunzellen (lymphoide, myeloischen und NK, DCs). Die gefärbten Proben wurden analysiert mit multi-Color FACS um Zahlen von Immunzellen der verschiedenen Linien, sowie ihr relativer Anteil innerhalb von Tumoren zu bestimmen. Die immun Profile der orthotopen Tumoren wurden dann mit den SC Tumoren verglichen. Die vorläufigen Daten bewiesen deutlich erhöhten eindringende TILs/TAMs in Tumoren in der Bauchspeicheldrüse und höhere B-Zell-Infiltration in Orthotopic anstatt SC Tumoren.
Introduction
Duktales Pankreaskarzinom (PDAC) bewirkt, dass fast eine halbe million Todesfälle weltweit jährlich eines der Top-5-Krebs-Killer. Es gibt einige wirksame Behandlungsmöglichkeiten und keine zugelassenen Immuntherapien; neue Behandlungen sind daher dringend erforderlich. Krebserkrankungen werden zunehmend als immunologische Erkrankungen, einschließlich PDAC, zusätzlich zu den Erbkrankheiten, wie heute bekannt anerkannt wird. Immunologische und genetische Faktoren würde wahrscheinlich feststellen, Prognose sowie Behandlung Ergebnisse. Tumoren Host immunüberwachung umgehen und schließlich vorrücken, um zum Tod führen. Viele dieser immun Prozesse treten innerhalb der Tumor Mikroumgebung (TME)1,2,3,4 wo verschiedene Arten von Immunzellen zu interagieren, mit Tumorzellen, miteinander und mit anderen tumor Stromazellen Komponenten direkt oder indirekt über Zytokine die Krankheit Ergebnis letztlich zu bestimmen. Charakterisierung der Tumor immun Komponenten des TME oder Tumor Immunphänotypisierung, einschließlich Subtypisierung, Nummerierung und Lokalisierung von verschiedenen Linien von Immunzellen, ist daher entscheidend für Anti-Tumor Immunität zu verstehen. Im Falle der PDAC, es wurde vorgeschlagen, die erhöhte Tumor infiltrieren suppressive Makrophagen (TAM) und B-Zellen zur Vermeidung von T-Zell-Infiltration und/oder Aktivierung und ein hohes Maß von Fibrose5,6geführt haben.
Das gemeinsame Konzept zu immun TMEs experimentell untersucht Surrogat Tumor präklinischen Tiermodellen verwenden würden, vor allem relevanten Maus Tumor Modelle7, besonders Maus Phänomen (Homograft) oder gentechnisch veränderte Mausmodelle (GEMM) Krebserkrankungen, auf die vermeintlichen Ähnlichkeit von Maus und Mensch für Tumoren und Immunität8,9. Es ist in Wirklichkeit verstanden, dass es angeborene Unterschiede zwischen den beiden Arten10,11.
Transplantierten Maus Tumoren haben erhebliche betriebliche Vorteile gegenüber spontanen Tumoren7, nämlich synchronisierte Tumorentwicklung, im Gegensatz zu den elterlichen GEMM spontane Tumorentwicklung. Bestätigung der spontanen murinen Tumoren gelten Primärtumoren gewesen nie manipuliert, in Vitround Spiegelung original Maus Tumor Histo- / Molekulare Pathologie7sowie möglichen immun Profile. Diese murinen Homografts gelten oft als “eine Maus Version des Patienten abgeleitet Xenotransplantate (PDXs)”. Sie haben daher wahrscheinlich eine bessere Übersetzbarkeit als konventionelle Phänomen Zelle Linie abgeleitet Maus Tumoren12. Vor allem sind viele Homografts abgeleitet spezifische GEMM bestimmte menschliche Krankheitsmechanismen, z. B. Onkogenen Fahrer Mutationen sind so konstruiert, wobei diese Bestätigung sollte daher Vorteile auf ihre klinische Relevanz haben. Insbesondere entwickeln die KPC GEMM Maus PDAC innerhalb von 15 – 20 Wochen alt, die morphologisch rekapituliert menschlichen Erkrankungen mit überwiegend gut bis mäßig-differenzierten glandulären Architektur und hochangereichertes Stroma. Dieses Modell rekapituliert auch die häufigsten genetischen Eigenschaften der menschlichen PDAC, nämlich Kras aktivierende Mutation und P53 Verlust der Funktion, die in 90 % und 75 % der menschlichen PDAC, jeweils5,6auftreten.
Standorte der Transplantation sind auch vorgeschlagen worden, eine Rolle im Modell Übersetzbarkeit. Die spezifische Gewebe Umgebung, wie z. B. eine entsprechende orthotopen Umgebung könnte eine Nische für bestimmte Tumoren, Fortschritt, im Gegensatz zu der einheitlichen subkutaner (SC) Umgebungen für die häufigsten transplantierten Tumoren. Es wäre von besonderem Interesse wird bzw. was für einen Unterschied zwischen den beiden Standorten der Transplantation, in Bezug auf die immun-Mikroumgebung und die Relevanz für Krebserkrankungen, z.B.existiert. im Falle der PDAC.
Einer der wichtigsten Aspekte der immun Profilierung oder Immunphänotypisierung, soll Tumor infiltrieren Immunzellen der verschiedenen Linien, Nummern, relative Anteil innerhalb von Tumoren, sowie ihren Aktivierungsstatus und Standorte bestimmen. Dazu gehören Tumor-Infiltratrating Lymphoctyes (TILs, T- und B-), Tumor infiltrieren Makrophagen (TAMs), Tumor infiltrieren natürlichen Killer-Zellen (NKs) und Tumor-Resident dendritischen Zellen3,13,14 , 15 , 16 , 17und die subzelluläre Lokalisation von bestimmten Zellen18,19,20, etc.. Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortieren (FACS) oder Flow Cytometry ist eine einzellige Detection-Technologie, die häufig verwendet wird, um die spezifischen Parameter einer Zelle messen. Multi-Color flow Cytometry Maßnahmen mehrere Markierungen auf eine einzelne Zelle3,4,21 und ist die am häufigsten verwendete Methode zur Bestimmung der Zahlen und relativen Prozentsatz von verschiedenen Untergruppen von Immunzellen, auch innerhalb der Tumoren.
Dieser Bericht beschreibt die Verfahren für die Profilerstellung Tumor infiltrieren Immunzellen: 1) Implantation des orthotopen PDAC Maus Tumor Homografts, zusammen mit SC Implantation; (2) Tumor Gewebe Ernte und Vorbereitung der Einzelzelle über Tumor Dissoziation; (3) Flow Cytometry Analyse aller von den Zellen von Tumoren als Basislinie abgeleitet; (4) Vergleich der Baseline profile beider Transplantation Ansätze.
Protocol
Representative Results
Discussion
Obwohl Studien mit SC Tumore leichter durchgeführt werden, können Orthotopically implantierten Tumoren Modelle potenziell relevanter für präklinische pharmakologischen Studien (besonders I/O Untersuchungen) sein, verbesserte Übersetzbarkeit versorgen. Dieser Bericht soll helfen das interessierte Leser/Publikum, dass man direkt die technischen Verfahren zu visualisieren, die in ihrer jeweiligen Forschung verwendet werden können. Unsere Protokolle zeigen, dass orthotopen Implantation der PDAC kann dazu führen, dass …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren würden Dr. Jody Barbeau – Danke für das kritische lesen und Bearbeitung des Manuskripts und danken Ralph Manuel für die Gestaltung von Kunstwerken. Die Autoren möchten auch die Krone Bioscience Onkologie Immuno-Onkologie Biomarker Team und Onkologie In Vivo -Team, für ihre großen technischen Bemühungen danken.
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
References
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