Immunophenotyping di Orthotopic omotrapianto (Syngeneic) dell'Adenocarcinoma Ductal pancreatico murino primario KPC tramite flusso Cytometry
Summary
La procedura sperimentale su immunophenotyping di omotrapianti PDAC murino ortotopico mira a profilatura immuno-microambiente tumorale. I tumori sono orthotopically impiantato tramite intervento chirurgico. Tumori di 200 – 600 mm3 dimensioni sono state raccolte e dissociati per preparare sospensioni unicellulari, seguite da analisi dell’indicatore multi-immuni FACS usando diversi anticorpi fluorescente etichettati.
Abstract
Omotrapianto (syngeneic) tumori sono il cavallo di battaglia di ricerca preclinica di immuno-Oncologia (i/o) di oggi. Il microambiente tumorale (TME), in particolare sua immunitario-componenti, è di vitale importanza per la prognosi e la previsione di risultati di trattamento, specialmente quelli di immunoterapia. TME immunitario-componenti sono composte di diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie tumore-infiltrazione valutabile da FACS multi-colore. L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) è tra i più letali malignances mancano opzioni di buon trattamento, così un’esigenza medica urgente e insoddisfatta. Una ragione importante per la sua non-risposta alle varie terapie (chemio-, mirati, I/O) è stata la sua abbondante TME, composto da fibroblasti e leucociti che proteggono le cellule del tumore da queste terapie. Orthotopically PDAC impiantato è creduto per più accuratamente riconquistare la TME di cancri del pancreas umani rispetto ai modelli convenzionali sottocutanei (SC).
Tumori dell’omotrapianto (KPC) sono trapianti di mouse spontanea PDAC originari da KPC-topi geneticamente ingegnerizzati (ras diKG12D / +/P53– / –/Pdx1-Cre) (KPC-GEMM). Il tessuto del tumore primario è tagliato in piccoli frammenti (~ 2 mm3) e trapiantato per via sottocutanea (SC) ai destinatari syngeneic (C57BL/6, 7 – 9 settimane di età). Gli omotrapianti erano quindi chirurgicamente orthotopically trapiantato sul pancreas dei topi C57BL/6 nuovi, insieme a SC-impianto, che ha raggiunto volumi del tumore di 300 – 1.000 mm3 da 17 giorni. Solo i tumori di 400 – 600 mm3 sono state raccolte per la procedura di analisi approvati e puliti per rimuovere i tessuti non tumorali adiacenti. Essi fossero dissociati per protocollo utilizzando un dissociatore di tessuto in sospensioni unicellulari, seguite dalla macchiatura con pannelli designati di anticorpi fluorescente-etichetta per i vari indicatori di diverse cellule immunitarie (linfoidi, mieloidi e NK, DCs). I macchiato campioni sono stati analizzati utilizzando multi-colore FACS per determinare i numeri delle cellule immuni di stirpi differenti, come pure la loro percentuale relativa all’interno dei tumori. I profili immuni di orthotopic tumori poi sono stati confrontati a quelli dei tumori SC. I dati preliminari hanno dimostrato significativamente elevata infiltrazione TILs/TAMs nei tumori sopra pancreas e infiltrazione della B-cellula superiore orthotopic piuttosto che i tumori SC.
Introduction
L’adenocarcinoma duttale pancreatico (PDAC) fa sì che quasi la metà un milione mortalità universalmente ogni anno, uno dei top 5 cancro killer. Ci sono poche opzioni terapeutiche efficaci e nessun immunoterapie approvati; di conseguenza, nuovi trattamenti sono disperatamente necessari. I cancri sempre più stanno riconoscendi come malattie immunologiche, tra cui PDAC, oltre le malattie genetiche come la conosciamo oggi. Fattori immunologici e genetici probabilmente sarebbero determinare prognosi della malattia così come il trattamento dei risultati. I tumori eludere la sorveglianza immunitaria ospite e finalmente avanzano per causare la morte. Molti di questi processi immunitari si verificano all’interno del microambiente tumorale (TME)1,2,3,4 dove diversi tipi di cellule immunitarie interagiscono con le cellule del tumore, con l’altro e con altri del tumore componenti stromal, direttamente o indirettamente tramite citochine che determinano l’esito della malattia. Di conseguenza, caratterizzazione dei componenti immunitarie tumore della TME o tumore immunophenotyping, tra cui la definizione di sottotipo, la numerazione e la localizzazione degli stirpi differenti delle cellule immuni, è fondamentale per comprendere l’immunità anti-tumorale. Nel caso di PDAC, è stato proposto che elevati di tumore-infiltrazione di macrofagi soppressivi (TAM) e cellule di B hanno portato alla prevenzione di infiltrazione a cellula T e/o attivazione e alti livelli di fibrosi5,6.
L’approccio comune per indagare sperimentalmente TMEs immuni sarebbe utilizzando modelli animali preclinici di surrogato del tumore, il tumore del mouse principalmente i modelli7, particolarmente del mouse syngeneic (omotrapianto) o modelli murini geneticamente (GEMM) di cancri, sulla presunta somiglianza di mouse e umani per tumori e immunità8,9. È inteso in realtà che ci sono differenze intrinseche tra le due specie10,11.
Tumori trapiantati del topo hanno notevoli vantaggi operativi rispetto tumori spontanei7, vale a dire lo sviluppo del tumore sincronizzata, in contrasto con lo sviluppo di tumore spontaneo GEMM parentale. Gli omotrapianti di tumori murini spontanei sono considerati tumori primari non essendo mai stato manipolato in vitroe tumore del mirroring del mouse originale histo- / molecolare patologia7, nonché possibili profili immuni. Questi omotrapianti murini sono spesso considerati “una versione del mouse degli xenotrapianti paziente-derivati (PDXs)”. Hanno quindi probabilmente una migliore traducibilità rispetto convenzionale delle cellule syngeneic del mouse linea-derivato tumori12. In particolare, molti gli omotrapianti sono derivati da GEMM specifici dove meccanismi di malattia umana specifica, ad esempio mutazioni oncogeniche driver, sono progettati e questi omotrapianti dovrebbero quindi avere vantaggi per la loro rilevanza clinica. In particolare, KPC GEMM sviluppano mouse PDAC entro 15-20 settimane di età, che ricapitola morfologicamente malattia umana con prevalentemente bene – a-differenziato moderatamente architettura ghiandolare e altamente arricchito lo stroma. Questo modello inoltre ricapitola le caratteristiche genetiche più comuni del PDAC umana, vale a dire Kras attivazione mutazione e P53 perdita di funzione, che si presentano nel 90% e 75% di umano PDAC, rispettivamente5,6.
Siti di trapianto sono stati suggeriti anche a svolgere un ruolo in traducibilità modello. Ambiente specifico per il tessuto circostante, ad esempio un ambiente di orthotopic corrispondente, potrebbe essere una nicchia per tumori specifici per ambienti di progresso, in contrasto con l’uniforme sottocutanea (SC) per i tumori comunemente trapiantati. Sarebbe di particolare interesse se, e/o, che differenza esiste tra i due siti di trapianto, in termini di immunitario-microambiente e la rilevanza di cancro umano, ad es. nel caso di PDAC.
Uno degli aspetti più importanti di profilazione immuni, o immunophenotyping, consiste nel determinare il tumore-infiltrazione di cellule immuni di stirpi differenti, i numeri, percentuale relativa all’interno dei tumori, così come loro Stati di attivazione e luoghi. Questo include il tumore-infiltratrating lymphoctyes (TILs, sia T – e B-), tumore-infiltrazione macrofagi (TAMs), tumore-infiltrazione di cellule di assassino naturali (NKs) e tumore-residente dendritiche cellule3,13,14 , 15 , 16 , 17e la localizzazione subcellulare di determinate cellule18,19,20, ecc. Fluorescenza attivato Cell Sorting (FACS) o flusso cytometry è una tecnologia di rilevamento a cella singola che è comunemente usata per misurare i parametri specifici di una cella. Multi-colore flusso cytometry misure marcatori multipli in una singola cella3,4,21 ed è il metodo più comunemente utilizzato per determinare i numeri e la percentuale relativa delle diverse sottopopolazioni di cellule immunitarie, compresi quelli all’interno dei tumori.
Questo rapporto descrive le procedure per la profilatura di tumore-infiltrazione di cellule immuni: 1) l’impianto di orthotopic PDAC topo tumore gli omotrapianti, insieme con l’impianto di SC; 2) tumore del tessuto raccolto e preparazione di singola cellula tramite dissociazione del tumore; 3) analisi di citometria a flusso di tutte le cellule derivate da tumori come una linea di base; 4) confronto dei profili di linea di base di entrambi gli approcci di trapianto.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sebbene più facilmente vengono condotti studi utilizzando i tumori SC, orthotopically impiantati tumori modelli possono essere potenzialmente più rilevanti per gli studi di farmacologia preclinica (in particolare le indagini di I/O) per fornire una maggiore traducibilità. Questo rapporto mira ad aiutare i lettori/pubblico interessato di essere in grado di visualizzare direttamente le procedure tecniche che possono essere utilizzate nelle loro rispettive ricerche. Nostri protocolli dimostrano che orthotopic l’impianto …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Gli autori vorrei ringraziare Dr. Jody Barbeau – per la lettura critica e di editing del manoscritto e grazie Ralph Manuel per la progettazione di opere d’arte. Gli autori vorrei anche ringraziare il team corona Bioscience oncologia Immuno-Oncology Biomarker e oncologia In Vivo , per i loro grandi sforzi tecnici.
Materials
| Anesthesia machine | SAS3119 | ||
| Trocar 20 | 2mm | ||
| Petri dish | 20mm | ||
| 100x antibiotic and antimycotic | |||
| Iodophor swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Alcohol swabs | Daily pharmacy purchase | ||
| Liquid nitrogen | Air chemical | ||
| Biosafety hood | AIRTECH | BSC-1300IIA2 | |
| FACS machine LSRFortessa X-20 | BD | LSR Fortessa | |
| antibodies | BD | ||
| Trevigen MD or BD Matrigel Basement Membrane Matrix High concentration | BD | 354248 | |
| FACS buffers | BD | 554656 | Mincing buffer |
| Brilliant Staining Buffer | BD | 563794 | |
| Mouse BD Fc Block | BD | 553142 | |
| cell filters | BD-Falcon | 352350 | 70µm |
| routine blood tube | BD-Vacutainer | 365974 | 2mL |
| Kaluza | Beckman | vs 1.5 | |
| 6-well plates | Corning | 3516 | |
| Foxp3 Fix/Perm kit | ebioscience | 00-5523-00 | |
| UltraComp eBeads | ebioscience | 01-2222-42 | |
| Centrifuge | eppendorf | 5810R,5920R | |
| FlowJo software | FlowJo LLC | vs 10.0 | |
| PBS | Hyclone | SH30256.01 | 50mL |
| RPMI 1640 | Hyclone | SH30809.01 | |
| Disposable, sterile scalpels | Jin zhong | J12100 | 11# |
| knife handle | Jin zhong | J11010 | |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | Y00030 | Eye scissors 10cm |
| eye scissors and tweezers | Jin zhong | JD1060 | Eye tweezers 10cm with teeth |
| Portable liquid nitrogen tank | Jinfeng | YDS-175-216 | |
| Electronic balance | Metter Toledo | AL204 | 0-100g |
| Miltenyi C-tubes | Miltenyi | 130-096-334 | |
| Miltenyi Gentle MACS with heater blocks | Miltenyi | 120-018-306 | |
| Tumor Dissociation Kit | Miltenyi | 130-096-730 | |
| Cell counter | Nexcelom | Cellometer | Cellometer Auto T4 |
| cryopreservation tube | Nunc | 375418 | 1.8ml |
| Cultrex High Protein Concentration (HC20+) BME | PathClear | 3442-005-01 | |
| syringes | Shanghai MIWA medical industry | 1-5mL | |
| Studylog software | Studylog | software | |
| Studylog-Balance and supporting USB | OHAUS | SE601F | Balance and supporting USB |
| Studylog-Data line of vernier calipers | Sylvac | 926.6721 | Data line of vernier calipers |
| Caliper | Sylvac | 910.1502.10 | Sylvac S-Cal pro |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339653 | 50mL |
| Sterilized centrifuge tubes | Thermo | 339651 | 15mL |
| Ice bucket | Thermo | KLCS-288 | 4°C |
| Ice bucket | Thermo | PLF-276 | —20°C |
| Ice bucket | Thermo | DW-862626 | —80°C |
| RNAlater | Thermo | am7021 |
References
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